專利名稱：制備模塊融合蛋白表達產物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學方法 和實施該方法的產品。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼模塊型蛋白質的核酸的克隆方法，所述模塊可順序加入預定位置。
背景技術：
本領域已知克隆核酸的重組DNA技術和分子生物學方法。這種方法包括利用限制性內切酶、連接酶、核苷酸/核苷激酶和磷酸酶、聚合酶及其它分子生物學工具操作核酸，從而產生所需的重組核酸。已出版的幾種實驗室手冊可以作為分子生物學研究者的參考書籍。這些參考手冊的例子包括:Sambrook, J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis, 1989,《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,冷泉港,紐約:冷泉港實驗室出版社；Joseph Sambrook和David Russell, 2001,《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第三版,冷泉港，紐約:冷泉港實驗室出版社。本領域的問題之一是缺乏方法來工程改造嵌合蛋白質表達產物，而能方便地將模塊元件插入嵌合體內所需位置。總之，雖然已成功制備了雜交或嵌合蛋白質，但合成的目的是為在終產物(不想局限于預定的機制)中加入更多的模塊。本發(fā)明的一方面考慮到嵌合體及其變體的未來需求和能制備它們而無需每個都從頭開始以解決該問題。本發(fā)明的一個實施方式總體上涉及制備融合蛋白表達產物的方法。本發(fā)明的另一實施方式涉及含有預先經工程改造的模塊型融合蛋白表達產物的制備方法。本發(fā)明另一方面涉及構建區(qū)段分子或模塊，這種模塊預先設計成能插入嵌合蛋白質表達盒。本發(fā)明還涵蓋了可用于所披露方法的工程改造模塊的文庫。一個實施方式制備了含有預定限制性位點的模塊。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及制備模塊型嵌合蛋白表達產物的方法和該方法所用的組合物。具體地說，本發(fā)明涉及順次、定向克隆編碼多肽模塊的多核苷酸。各可克隆元件含有側接預定的限制性位點的開放讀框。這些方法包括利用可克隆元件和含有這些元件的載體作為重組DNA技術的起始材料。本發(fā)明的優(yōu)點之一是能快速而方便地制備許多融合蛋白變體，而無需設計和評估后續(xù)的各克隆步驟。本發(fā)明的一個實施方式通常涉及制備融合蛋白表達產物的方法。本發(fā)明的另一實施方式涉及含有組合模塊的融合蛋白表達產物的制備方法。本發(fā)明另一方面涉及構建嵌段分子或模塊，這種模塊預先設計成能插入嵌合表達盒。本發(fā)明還涵蓋了可用于所披露方法的模塊文庫。一個實施方式制備了含有預定限制性位點的模塊。各可克隆元件或模塊含有編碼感興趣開放讀框，例如但不限于:全長蛋白質或多肽、或功能域、結構域、酶結構域、抑制區(qū)、結合區(qū)、定位信號、表位、外顯子、或其它所需的亞成分的多核苷酸序列?？蓮膰裔t(yī)藥圖書館獲得有關模塊蛋白質信息的數(shù)據(jù)庫，其稱為保守性結構域數(shù)據(jù)庫或CDD，該數(shù)據(jù)庫代表了可根據(jù)蛋白質家族和物種之間保守的氨基酸序列同源性來鑒定結構域的一種來源。全長蛋白質的非限制性例子包括激酶、激酶亞基、磷酸酶、磷酸酶亞基、肽配體、蛋白酶、蛋白酶亞基、酶亞基、DNA結合蛋白亞基、g_蛋白亞基、離子通道亞基和膜受體亞基，僅是舉例。功能域的非限制性例子包括DNA結合區(qū)、轉錄激活區(qū)、二聚體化功能域、催化域、磷酸化區(qū)、調節(jié)區(qū)、死亡結構域、普列克底物蛋白同源結構域、脂質結合區(qū)、激素結合區(qū)、配體結合區(qū)、鋅指區(qū)、亮氨酸拉鏈區(qū)、g_蛋白結合區(qū)、糖基化區(qū)、酰化區(qū)和跨膜區(qū)，僅是舉例。結構域的非限制性例子包括a螺旋區(qū)、β片尾區(qū)、酸性區(qū)、堿性區(qū)、疏水區(qū)、鏈內二硫鍵區(qū)(intra-chain disufide bonding domain)、輔因子結合區(qū)和金屬離子結合區(qū)，僅是舉例。酶結構域的非限制性例子包括酶活性位點、磷酸化催化域、磷酸酶催化域、腺苷酸環(huán)化酶催化域、代謝酶活性位點、蛋白酶活性位點、聚合酶活性位點、酯酶活性位點、糖酵解途徑酶活性位點、核苷酸合成酶活性位點、和氨基酸合成酶活性位點，僅是舉例。抑制區(qū)的非限制性例子包括激酶抑制性亞基結合區(qū)(kinase inhibitorysubunit binding region)、磷酸酶抑制性亞基結合區(qū)和別構配體結合區(qū),僅是舉例。結合區(qū)的非限制性 例子包括類固醇激素結合區(qū)、肽激素結合區(qū)、底物結合區(qū)、ATP結合區(qū)、PDZ結構域、SH3結構域、SH2結構域、PBl結構域、藥物結合區(qū)、g_蛋白結合區(qū)、DNA結合區(qū)、脂質結合區(qū)、碳水化合物結合區(qū)和二聚體化功能域，僅是舉例。定位信號的非限制性例子包括內質網定位信號、核定位信號、線粒體定位信號、質膜定位信號和肌質網定位信號，僅是舉例。表位的非限制性例子包括血凝素表位、C-MyC表位、FLAGe, Hi s6、酸性區(qū)、堿性區(qū)和抗體結合區(qū)，僅是舉例。在自然界中，蛋白質結構域常與外顯子有關。據(jù)信，天然外顯子改組是真核生物中存在模塊蛋白質的一種解釋。因此，外顯子的開放讀框代表了本發(fā)明的感興趣開放讀框。本領域技術人員知道一些外顯子在對應于剪接位點的末端含有一些切割密碼子(splitcodon)。當該情況發(fā)生時，含有正確開放讀框的外顯子部分或區(qū)段即是感興趣的0RF。模塊還可含有編碼自然界中不存在，但具有所需特征或特性的肽的多核苷酸序列。本文所用的術語“模塊”表示編碼開放讀框的核酸，所述開放讀框包括側接預定限制性位點的感興趣開放讀框。如果將本發(fā)明方法和產物用于哺乳動物系統(tǒng)，所述模塊應不含哺乳動物終止密碼子。本發(fā)明模塊可以是較大多核苷酸，例如載體的一部分。這種載體包括但不限于:環(huán)狀質粒、表達載體、病毒載體或人工染色體。所述模塊中預定的限制性核酸內切酶位點在該模塊內是獨特的。在本發(fā)明的一個實施方式中，模塊的預定限制性位點在包含該模塊的載體或其它核酸內是獨特的。在本文中，預定的限制性位點在載體內提供獨特的克隆位點并提供模塊克隆的方向。


圖1顯示了利用兩種環(huán)狀起始DNA，以N-末端至C-末端方向構建融合蛋白的方法。圖2顯示了利用兩種環(huán)狀起始DNA，以C-末端至N-末端方向構建融合蛋白的方法。圖3顯示了利用一種環(huán)狀起始DNA和一種線形起始DNA，以N-末端至C-末端方向構建融合蛋白的方法。圖4顯示了利用兩種線形起始DNA，以N-末端至C-末端方向構建融合蛋白的方法。圖5顯示以N-末端至C-末端方向構建融合蛋白的循環(huán)方法。

圖6A-6C顯示了嵌合多肽的例子，其中各模塊衍生自外顯子的各部分。圖7A-7C顯不了嵌合多肽的例子,其中一個模塊含有定位信號。圖8A-8C顯不了融合蛋白的例子,其中一個模塊含有表位標簽。圖9A-9C顯示了融合蛋白的例子，其中諸模塊含有不同的功能域。圖10顯示了含有本發(fā)明方法制備的嵌合蛋白編碼序列的示例性表達盒。圖11顯示了含有側接預定限制性位點的感興趣開放讀框(ORF)和填充片段的示例性模塊。圖12顯示了本發(fā)明可用的模塊文庫的例子。文庫成員含有相同的預定限制性位點，表示為位點1、位點II和位點III。開放讀框未按比例繪制，因此長度可能不同。在一個實施方式中，載體DNA包含所述文庫成員。在一個實施方式中，所述載體是環(huán)狀質粒。圖13顯示了采用動態(tài)組合合成制備融合蛋白的方法。該圖中的縮寫如下所示:N4代表NgoM IV ;X1代表Xma I ;C1代表CIa I ;fwd表示正向；rev表示反向；V代表殘留的NgoM IV 和 Xma I 位點。圖14A-14D顯示了含有模塊化嵌合多肽基因構建物的載體的例子。
具體實施例方式自然界中許多蛋白質是模塊化的。例如，核受體的結構域包括:DNA結合區(qū)、配體結合區(qū)、二聚體化功能區(qū)和激活區(qū)。常需要在受體之間交換功能區(qū)來制備嵌合受體，從而能研究結構域的功能和/或制作新的研究和治療工具。也需要合成具有新的細胞活性或治療活性的融合蛋白。例如，已從各種異源蛋白質來源設計并合成了能調節(jié)蛋白激酶D活性的嵌合型多重配體(參見60/728，259)。本發(fā)明一方面涉及融合蛋白的組合模塊和制備可摻入融合蛋白表達盒中任何所需位置的開放讀框的構建嵌段。換言之，本發(fā)明包括設計成一起使用的組件庫清單，其方式類似于LEGOk構建嵌段或連鎖模塊底板(interlocking modular flooring)。本發(fā)明的其它方面是方便地制備這些模塊型融合蛋白的方法。在該方面，本發(fā)明的一個實施方式包括組件蛋白質結構域的模塊克隆方法。為便于克隆，需要制備與粘性末端相容并能順次插入和克隆的模塊元件。本發(fā)明一實施方式通過利用限制性核酸內切酶位點識別和切割的天然特性實現(xiàn)該目的。本發(fā)明另一方面包括含有開放讀框的模塊，該開放讀框在ORF —側的側接序列用于一次性限制性酶消化，而另一側的側接序列如需要可用于多次限制性酶消化。換言之，利用和破壞模塊中的預定限制性位點可實現(xiàn)模塊元件的遞推順次克隆。多肽和多核苷酸序列詳述SEQ ID NO:1是核酸模塊的例子。該模塊具有如下所示的5’ _3’結構:5’ -預定的限制性位點-感興趣多肽的開放讀框(ORF)-預定的限制性位點-填充片段-預定的限制性位點_3’。這種預定的限制性位點和填充片段還編碼哺乳動物的氨基酸并與感興趣多肽同在框內，因此整個模塊是一種組合的開放讀框。SEQ ID N0:1描述于圖11。SEQ ID NO: 2 是由 SEQ ID NO:1 編碼的多肽。實施例1:以兩種載體開始的方法采用以下方法，以兩種物質開始制備模塊型融合蛋白，這兩種物質各含有側接預定限制性位點的感興趣開放讀框(ORF)。側接感興趣ORF的限制性位點的例子是限制性內切酶NgoM IV和CIa I ;*Xma I和CIa I識別的序列(參見圖1)。參考圖1，所述方法的一個實施方式利用兩種起始核酸。一種核酸是含有感興趣開放讀框(ORFl)的環(huán)狀DNA，此開放讀框的5’端側接NgoM IV位點，3’端順次側接Xma I位點和CIa I位點。換言之，第一種核酸含有從5’到3’具有以下特征的DNA:—NgoM IV-ORFl-Xma 1-填充片段-Cla I—。再參考圖1，第二種核酸是也含有感興趣開放讀框(0RF2)的環(huán)狀DNA，此開放讀框的5’端側接NgoM IV位點，3’端順次側接Xma I位點和CIa I位點。填充片段表示為兩個不同限制性酶提供了足夠空間而可結合和切割此DNA的核苷酸。術語“填充片段”與“間隔臂”同義，本文中該兩術語可互換使用。填充片段或間隔臂通常應與毗連的開放讀框同在框內，因此其長度應是3的倍數(shù)，因為密碼子長3個堿基。示例性的填充片段是GGAGGCGGA，其編碼GlyGlyGly0填充片段/間隔臂可含有其它氨基酸組成。本發(fā)明模塊克隆方法的一實施方式包括用Xma I和CIa I切割第一環(huán)狀DNA，產生含有3’Xma I突出端和5’CIa I突出端的線形DNA。該DNA片段是受者DNA(acceptorDNA)，其將接受第二環(huán)狀DNA的切割后插入物。在一獨立的容器中，用NgoM IV和CIa I切割稱為供者的第二環(huán)狀DNA，產生釋放的含有3’ CIa I突出端和5’ NgoM IV突出端的線形DNA。然后純化該第二 DNA片段使之與其線性化的載體主鏈DNA分離。這些限制性消化可產生含有相容粘性端的第一和第二 DNA片段。當這些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并連接形成第三環(huán)狀DNA片段時，第一 DNA中的Xma I位點和第二 DNA中的NgoM IV位點在第三環(huán)狀DNA中遭到破壞?，F(xiàn)在，DNA的該殘留區(qū)受到保護以免受Xma I或NgoM IV的進一步消化，但第三環(huán)狀DNA中側接所得融合開放讀框的序列仍含有完整的5’ NgoM IV和3’ Xma I及CIa I位點，從而可用于后續(xù)遞推克隆步驟。該方法可重復多次直至實現(xiàn)定向、順次的、模塊化克隆結果。在圖1所述例子中，模塊加入的方向從融合蛋白的N-末端至C-末端；而在圖2所述例子中，模塊加入的方向從嵌合蛋白的C-末端至N-末端。NgoM IV、Xma I和CIa I核酸內切酶識別的限制性位點代表如果用于模塊中 可進行遞推順次克隆的三個位點。
本領域技術人員知道NgoM IV位點和Xma I位點彼此可以交換，只要這種順序在這些核酸中一致(例如參見圖4)。本領域普通技術人員還知道可用其它限制性位點基團來實現(xiàn)本文所述的順次定向克隆。選擇限制性核酸內切酶的優(yōu)選標準是:1)選擇的一對核酸內切酶應能產生相容的粘性末端，但彼此連接后其位點遭到破壞；2)選擇的第三限制性核酸內切酶不能產生與前兩個粘性末端任何一個相容的粘性末端。當將這種標準用作順次定向克隆的系統(tǒng)時，可按需要組合裝配蛋白質亞域、模塊和其它編碼區(qū)或表達組件。對于上述I號選擇標準，可用其它限制性核酸內切酶實施該方法。例如，當用NgoMIV、Xma I,TspM I,BspE I和Age I切割含有其各自識別位點的DNA時，均能產生互補的突出端。因此，與本實施例和本文所述其它實施例中NgoM IV和Xma I的使用方式一樣，通?？蓪⑼嘶鸷瓦B接時識別位點被破壞的這些酶中的任意兩種作為一對應用。對于表達這種融合蛋白的物種，選擇限制性核酸內切酶的其它標準可包括密碼子選擇/密碼子偏愛。在一個實施方式中，優(yōu)選NgoM IV與Xma I配對，因為它們均利用哺乳動物細胞識別的密碼子。其它選擇標準還可包括密碼子所編碼氨基酸的特性。例如，可能需要避免其密碼子編碼荷電氨基酸的限制性核酸內切酶位點。在圖1所示的實施方式中，NgoM IV和Xma I是優(yōu)選的配對，因為所編碼的氨基酸相對是生物學中性的(bioneutral):NgoM IV在哺乳動物中編碼AlaGly，而Xma I在哺乳動物中編碼ProGly (還參見圖11)。本領域技術人員應知道利用其它物種所用的密碼子可改進該方法使之適用于其它物種。實施例2:因一種載體開始的方法除了環(huán)狀DNA夕卜，定向和順次裝配編碼區(qū)模塊的另一方法利用線形DNA。例如，與上述順次克隆方法相似，側接編碼區(qū)的限制性位點是限制性內切酶NgoM IV和CIa I ;或Xma I和CIa I所識別的序列。參考圖3，用Xma I和CIa I切割第一環(huán)狀DNA，產生含有3’Xma I突出端和5’CIa I突出端的線形DNA。該第一 DNA是受者。第二 DNA是線形雙鏈DNA片段，其通過合成和退火互補的寡核苷酸或通過PCR擴增然后用合適的限制性內切酶消化以形成突出端而產生。 第二線形DNA含有3’CIa I突出端和5’NgoM IV突出端，此二突出端與第一線形化DNA受者的粘性末端互補。當這些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并連接形成第三環(huán)狀DNA時，第一DNA中的Xma I位點和第二 DNA中的NgoM IV位點在第三環(huán)狀DNA中遭到破壞。然而，第三環(huán)狀DNA側接所得的感興趣融合蛋白的序列仍含有完整的5’ NgoM IV和3’ Xma I及CIaI位點，從而隨后可用于連續(xù)克隆步驟中。該方法可重復多次以實現(xiàn)定向、順次的模塊克隆(參見圖5)。NgoM IV、Xma I和CIa I核酸內切酶識別的限制性位點代表如果用作側接序列則可進行遞推模塊克隆的三個位點。實施例3:用兩種線形雙鏈DNA開始的方法還可用兩種線形DNA作為起始物質來實施本發(fā)明方法。在本實施例中，與本文的其它實施例相比，NgoM IV和Xma I位點已交換。參考圖4，所述兩種起始物質是:I)含有3' NgoM IV突出端和5’CIa I突出端的載體主鏈，其中感興趣的開放讀框(ORF Z)位于NgoMIV位點上游，而Xam I位點位于框內在ORF Z上游；和2)含有5’ Xma I突出端和3’ CIa I突出端的雙鏈DNA開放讀框，其中Xma I突出端緊鄰感興趣開放讀框ORF X上游并與其同在框內，ORF X下游是NgoM IV位點，也與ORF X同在框內?？刹捎酶鞣N方法提供或合成該兩種起始核酸。例如，通過限制性核酸內切酶消化、化學合成、PCR擴增，僅是舉例。本領域知道這些核酸中的突出端可以是限制性核酸內切酶消化的產物，或可以作為接頭或適體加入各末端。兩種起始核酸的退火和連接可產生上游側接完整的Xam I位點，而下游側接完整的NgoM IV和CIa I位點的嵌合型多肽(ORF Z-ORFX)，如果需要加入一個或多個模塊則可重復該方法。NgoM IV或Xma I不再能切割連接的NgoM IV/Xma I區(qū)域(表示為殘留的NgoM IV、Xma I位點)，因此受到保護而免遭這些酶的進一步消化。實施例4:模塊文庫以上實施例中所述的起始物質可以是物質集合或文庫的成員。集合的各成員共享許多特征。共享的最小特征包括側接感興趣開放讀框的相同預定限制性位點(例如NgoMIV、Xma IXIa I)。還可工程改造該感興趣的開放讀框，使其在內部不含這些相同的限制性位點。此外，至少所述第一起始核酸(受者DNA)是環(huán)狀DNA，其經工程改造而在整個環(huán)狀DNA中，即在感興趣開放讀框的側接位點處含有這些相同的限制性位點。換言之，受者DNA載體經工程改造而在任何地方不含這些預定的限制性位點。在本發(fā)明的一個實施方式中，供者和受者核酸均是環(huán)狀DNA，并且除了感興趣的開放讀框外均相同。在另一實施方式中，所述供者環(huán)狀DNA與受者DNA不同之處在于感興趣ORF的側接限制性位點(感興趣ORF中不存在)在環(huán)狀DNA分子中不是獨特的。這是可能的，因為可以純化釋放的插入物使之與載體的其余部分分離。本領域普通技術人員知道NgoM IV位點和Xma I位點彼此可以交換，只要這種順序在這些核酸中一致。本領域普通技術人員還知道可利用其它限制性位點基團。在一個實施方式中，所述文庫成員具有包含感興趣開放讀框的模塊，所述模塊由圍繞預定限制性位點的哺乳動物密碼子構成，所述位點編碼與該開放讀框同在框內的氨基酸，并且其密碼子是哺乳動物所用的。圖11顯示了這種文庫成員的一個實施方式，其含有感興趣的多聚賴氨酸0RF。從圖11可以看出，NgoM IV識別序列(GCCGGC)編碼AlaGly ;ORF (AAGAAGAAAA AGAAGAAG)編碼 LysLysLysLysLysLys ；Xma I 識別序列(CCCGGG)編碼ProGly ;填充片段(GGCGGAGGC)編碼GlyGlyGly ；Cla I 識別序列(ATCGAT)編碼 IleAsp。因此，此模塊本身是含有感興趣ORF的開放讀框。此模塊文庫經工程改造與側接各開放讀框的限制性位點一致，故可插入各模塊而無需設計進行各連續(xù)克隆步驟。文庫的可用組件包括感興趣的開放讀框和模塊的填充片段和/或間隔臂，只要所有組件能利用要表達該融合蛋白的物種的密碼子，并且每個感興趣的ORF不含此預定的限制性位點。本發(fā)明的模塊文庫不同于本領域已知的其它文庫，例如cDNA文庫。雖然cDNA文庫通常含有側接載體限制性位點的蛋白質編碼序列，但這些蛋白質編碼序列不一定是開放讀框；側接蛋白質編碼序列的載體限制性位點未經工程改造而不含蛋白質編碼序列，這些限制性位點也未經工程改造而與毗連編碼序列同在框內，這些限制性位點也不能進行本發(fā)明的遞推克隆步驟。本發(fā)明文庫與cDNA文庫的不同還在于cDNA文庫含有非編碼序列，例如3’和5’非翻譯區(qū)(UTR)。圖12顯示了本發(fā)明所用模塊文庫的例子。實施例5:構建均質多聚融合蛋白均質多聚(homomultimeric)融合蛋白的一個例子是含有,例如0RF8的二聚體或多聚體多肽(參見圖5)。感興趣的開放讀框0RF8可以是任何長度或組成。例如，0RF8可以是蛋白激酶D的肽抑制劑。當構建本發(fā)明環(huán)狀DNA的均質多聚體時，兩種起始核酸相同。然而，要進行兩次分開的限制性消化。采用實施例1的相同示范性限制性位點位置，在一個容器中用Xma I和CIa I消化一種起始核酸，在另一容器中用NgoM IV和CIa I消化另一種起始核酸。將線形化的載體DNA與釋放的插入物混合、退火并連接得到0RF8的融合二聚體。這些步驟可以重復多次直至獲得所需數(shù)量的模塊。如圖5所示，還可從兩種線形DNA分子開始。本領域技術人員知道所述方法的改進形式。實施例6:構建異質多聚融合蛋白異質多聚(heteromultimeric)融合蛋白的一個例子是含有至少兩個不同模塊的多肽。圖6A-6C顯示了從含有外顯子衍生的感興趣ORF的模塊構建的一些異質多聚融合蛋白。圖7A-7C顯示了其中一個模塊含有定位信號的示范性融合多肽。圖8A-8C顯示了其中一個模塊含有表位標簽的不范性嵌合多肽。圖9A-9C顯不了從含有不同功能域的模塊構建的示范性嵌合多肽。本文所述的任何方法可用于制備異質多聚融合多肽。此外，隨后可用哺乳動物細胞表達該融合蛋白。圖10顯示了含有本發(fā)明制備的嵌合蛋白編碼序列的示范性表達盒。該融合蛋白可用作研究工具或作為治療劑。實施例7:分步組合合成本發(fā)明方法可用于同時組合合成幾種異質多聚體。雖然消化、純化、混合和連接步驟如上所述，但如下所示組合反應容器。本實施例是從4種環(huán)狀起始DNA裝配可能的每種異質多聚融合蛋白的合成方法，各多聚體含有命名為模塊A、模塊B、模塊C和模塊D的不同模塊編碼序列。例如，理論上得到的異質多聚體數(shù)量是44個，包括模塊A-模塊B-模塊C-模塊D ;模塊B-模塊C-模塊D-模塊A ;模塊C-模塊A-模塊D-模塊B等以及各模塊的均質多聚體。分別在不同容器中用Xma I和CIa I切割使4種不同受者環(huán)狀DNA線形化。在另外4個不同的容器中，用NgoM IV和CIa I切割4種不同的插入供者。純化供體消化而釋放的插入物獲得含有Ng oM IV和CIa I突出端的模塊A、模塊B、模塊C和模塊D這4種編碼DNA。下一步驟是在同一受者容器中混合等份的各插入物與各受者。因此，各受者得到4種不同的等份(插入物)。加入各受者的各插入物摩爾濃度是能有效實現(xiàn)所需化學計量的用量。例如，如果想制備數(shù)量大致相同的各類異質多聚體，可在每種受者DNA中加入各種摩爾數(shù)大致相同的4種供者插入物。插入物大小、組成和其它因素可影響所加入的摩爾數(shù)。這4種混合物經退火和連接后，產生了以下融合二聚體。含有模塊A的受者產生的:模塊A-模塊A模塊A-模塊B模塊A-模塊C模塊A-模塊D含有模塊B的受者產生的:模塊B-模塊A模塊B-模塊B模塊B-模塊C模塊B-模塊D含有模塊C的受者產生的:
模塊C-模塊A模塊C-模塊B模塊C-模塊C模塊C-模塊D含有模塊D的受者產生的:模塊D-模塊A模塊D-模塊B模塊D-模塊C
模塊D-模塊D由于不能用本實施例所用的預定限制性酶消化連接該融合蛋白DNA各模塊的連接鍵，重復線形化和加入等份插入物的上述步驟可加入更多插入物。此組合合成方法可用于同時產生大量嵌合體。然后可在細胞中測試這些嵌合體。實施例8:動態(tài)組合合成除了上述方法，本發(fā)明的模塊文庫可用于動態(tài)組合合成，該方法也能同時產生大量嵌合體。在同一反應混合物中存在許多相容的突出端并且彼此能退火和連接時可發(fā)生動態(tài)組合合成。與從N-末端向C-末端(或反之亦然)構建融合蛋白的上述遞推方法相反，該動態(tài)方法產生了反向和正向相連的沒有特定順序的插入物。雖然融合蛋白構建物的兩末端固定粒徑于所選擇的模塊(類似于上文使用的第一和第二 DNA)，但該融合蛋白的“中段”部分不同。在動態(tài)組合合成的最簡單例子中，用Xma I和CIa I消化本發(fā)明DNA文庫的受者DNA。然后用NgoM IV和CIa I消化第二 DNA。此外，用Xma I和NgoM IV消化也來自該文庫的第三DNA。分離消化的第二和第三DNA，從而保留含有感興趣ORF的多核苷酸。下一步驟是混合、退火和連接第一、第二和第三DNA。由于第三DNA因其含有NgoM IV和Xma I突出端而可以兩種不同方向與第一和第二 DNA退火，所得融合蛋白的“中段”具有兩種不同取向。動態(tài)組合合成的更復雜例子包括將用NgoM IV和Xma I切割的多個模塊與上述消化的第一和第二 DNA混合。當退火和連接含有這些突出端的多種DNA時，各模塊發(fā)生雙向取向連接(bidirectional orientation)。例如，如果將用NgoM IV和Xma I預先消化的5種模塊以粗略相似的化學計量用量混合、退火并連接時，所述5種模塊的每一種都應存在所有可能的順序和取向。此外，該融合蛋白的“中段”部分的總長度也可能不同，因為在融合蛋白中可能有一個或多個模塊不存在或存在多次。圖13是動態(tài)組合合成的非限制性說明。該圖只代表該方法可能產生的少數(shù)融合蛋白構建物。本領域技術人員知道可以獲得大量其它融合蛋白構建物。在一個實施方式中，本發(fā)明包括含有以下每一種元件的載體，這些元件順次排列從而形成模塊型開放讀框，所述載體包含:a)編碼第一組氨基酸的第一限制性位點，其中所述第一組氨基酸包括至少兩個氨
基酸；b)編碼感興趣多肽的第一開放讀框，其中所述感興趣多肽的編碼序列與所述第一限制位點的至少兩個氨基酸的編碼序列同在框內；
c)編碼第二組氨基酸的第二限制性位點，其中所述第二組氨基酸包括至少兩個氨基酸，所述第二限制性位點的第二組氨基酸編碼序列與所述第一開放讀框的感興趣多肽的編碼序列同在框內，所述第二限制性位點的多核苷酸序列與第一限制性位點的多核苷酸序列不同；d)間隔臂子多核苷酸序列，該間隔臂多核苷酸序列編碼至少3個間隔氨基酸，該間隔臂序列的編碼序列與第二限制性位點的多核苷酸序列同在框內；和e)編碼第三組氨基酸的第三限制性位點，其中所述第三組氨基酸包括至少兩個氨基酸，所述第三限制性位點的第三組氨基酸編碼序列與所述至少3個間隔氨基酸的編碼序列同在框內，所述第三限制性位點的多核苷酸序列與第一限制性位點的多核苷酸序列不同，并且所述第三限制性位點(的多核苷酸序列)與第二限制性位點的多核苷酸序列不同；其中元件(a)-(e)彼此同框相連從而形成此開放讀框模塊。在另一實施方式中，本發(fā)明包括其中諸元件以5’到3’方向排列的載體，此載體中元件(a)在該載體的5’端。另一實施方式包括其中諸元件以3’到5’方向排列的載體，此載體中元件(a)在該載體的3’端。在另一實施方式中，本發(fā)明包括的載體還包含與所述模塊型開放讀框的5’部分操作性相連的啟動子。所述啟動子可以是細菌或哺乳動物啟動子。其它實施方式包括還包含與第三限制性位點的3’端相連的非翻譯區(qū)的載體。在另一實施方式中，本發(fā)明包括或在第一或在第二限制性位點中產生的第一和第二限制(氨基酸)組之間的任何開放讀框中沒有限制性位點的載體。在另一實施方式中，本發(fā)明包括制備融合多肽的方法，包括，a)用識別第二和第三 限制性位點的限制性酶消化上述載體，從而產生含有第一和第二單鏈突出端的線形載體，其中所述第一和第二突出端彼此不相容；b)提供第一插入物，此第一插入物包含至少一個其它的開放讀框，此至少一個其它的開放讀框包含與所述第一和第二突出端相容的5’和3’突出端，此至少一個其它的開放讀框各自編碼至少一個其它的感興趣多肽；c)將此第一插入物連接入所述線形載體，從而形成連接的表達載體，其中至少一個開放讀框的5’突出端與所述線形載體的第一單鏈突出端退火相連，所述至少一個開放讀框的3’突出端與所述線形載體的第二個單鏈突出端退火相連，所述3’突出端的連接重新產生第三限制性位點，所述第一開放讀框與至少一個其它的開放讀框彼此同框相連。在另一實施方式中，本發(fā)明包括制備融合多肽的方法，包括，a)用識別其它的和重新產生的第三限制性位點的限制性酶消化上述連接的表達載體，從而產生含有第三和第四個單鏈突出端的線形載體，所述第三和第四個突出端彼此不相容；b)提供第二插入物，此第二插入物包含至少一個其它的開放讀框，此至少一個其它的開放讀框包含與所述第三和第四個突出端相容的5’和3’突出端，此至少一個其它的開放讀框各自編碼至少一個其它的感興趣多肽；c)將所述第二插入物連接入所述線形載體，從而形成新的連接表達載體，此載體中至少一個開放讀框的5’突出端與所述線形載體的第三個單鏈突出端退火相連，所述至少一個開放讀框的3’突出端與所述線形載體的第四個單鏈突出端退火相連，所述3’突出端的連接重新產生第三限制性位點，其中所有開放讀框彼此同在框內。在另一實施方式中，本發(fā)明包括制備融合多肽的方法，包括:a)用識別第二和第三限制性位點的限制性酶消化上述載體，從而產生含有第一和第二個單鏈突出端的線形載體，其中所述第一和第二突出端彼此不相容；b)提供第一插入物，此第一插入物包含至少一個其它的開放讀框，此至少一個其它的開放讀框包含與所述第一和第二個突出端相容的5’和3’突出端，此至少一個其它的開放讀框各自編碼至少一個其它的感興趣多肽；c)將此第一插入物連接入所述線形載體，從而形成連接的表達載體，此載體中至少一個開放讀框的5’突出端與所述線形載體的第一個單鏈突出端退火相連，所述至少一個開放讀框的3’突出端與所述線形載體的第二單鏈突出端退火相連，所述3’突出端的連接重新產生第三限制性位點，其中所述至少一個其它的開放讀框與第一開放讀框彼此同框相連。本發(fā)明的其它實施方式包括制備融合蛋白DNA構建物的方法，包括:a)提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感興趣的開放讀框，各個感興趣的開放讀框側接至少3個預定的限制性核酸內切酶位點，其中所述預定位點的2個具有相容的突出端，b)用能在所述預定限制性核酸內切酶位點的2個處進行切割的2種不同限制性核酸內切酶消化第一多核苷酸，從而產生含有2個不同突出端的多核苷酸，c)用能在所述預定限制性核酸內切酶位點的2個處進行切割的2種不同限制性核酸內切酶消化第二多核苷酸物質，從而釋放含有感興趣開放讀框的多核苷酸，此釋放的多核苷酸含有2個不同的突出端，其中一個突出端與步驟b)消化的多核苷酸的突出端相容，d)混合、退火和連接步驟b)所產生的多核苷酸與步驟c)的含感興趣開放讀框的釋放多核苷酸，從而產生含有融合開放讀框的第三多核苷酸，其中感興趣開放讀框之間的連接不再易受能在3個預定的限制性位點進行切割的任何一種核酸內切酶的消化，其中側接感興趣的融合開放讀框的序列含有所述3個預定的限制性位點。 在該方法中,第一多核苷酸可以是環(huán)狀DNA。此外,在該方法中,第一和第二多核苷酸是環(huán)狀DNA。另外，所述預定的限制性位點可以是NgoM IV、Xma I和CIa I識別的序列。通過重復步驟a)到d)，可以遞推重復該方法，其中步驟a)提供的第一多核苷酸被步驟d)產生的第三多核苷酸替代。其它實施方式包括制備融合蛋白DNA構建物的方法，包括:a)提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感興趣的開放讀框，各個感興趣的開放讀框側接至少3個預定的限制性核酸內切酶位點，其中所述預定位點的2個具有相容的突出端，b)用能在所述預定限制性核酸內切酶位點的2個處進行切割的2種不同限制性核酸內切酶消化所述第一多核苷酸，從而產生含有2個不相容突出端的多核苷酸， c)用能在所述預定限制性核酸內切酶位點的2個處進行切割的2種不同限制性核酸內切酶消化第二多核苷酸，其中所用限制性核酸內切酶中的一種與步驟b)的限制性核酸內切酶相同，從而釋放含有感興趣開放讀框的多核苷酸，此釋放的多核苷酸含有2個不相容同的突出端，d)混合、退火和連接步驟b)所產生的多核苷酸與步驟c)的含感興趣開放讀框的釋放多核苷酸，從而產生含有融合開放讀框的第三多核苷酸，其中融合的感興趣開放讀框側接所述預定的限制性位點，此感興趣開放讀框之間的連接處不含所述3個預定的限制性核酸內切酶位點。本發(fā)明的另一方面是分離多核苷酸的文庫，其中各多核苷酸含有側接至少3個預定限制性核酸內切酶位點的感興趣開放讀框，這3個預定的限制性位點中的2個彼此不相容，或3個預定的限制性位點中的2個彼此相容，各個感興趣開放讀框不含這種預定的限制性位點。更具體地說，該文庫含有多核苷酸，其中每種多核苷酸含有感興趣的開放讀框，各個感興趣開放讀框在一端側接可被NgoM IV切割的序列，各個感興趣開放讀框在另一端側接可被Xma I和CIa I切割的序列，或此種感興趣的開放讀框不含可被NgoM IV、Xma I和CIa I切割的序列。本發(fā)明還包括含有這些分離多核苷酸的載體以及含有所述載體的宿主細胞。圖14A顯示了含有嵌合蛋白基因構建物的載體，此載體中所述基因構建物可從載體釋放，成為產生轉基因動物所用的單元。例如，通過限制性核酸內切酶消化從載體主鏈釋放所述基因構建物(或轉基因)。然后將釋放的轉基因注入小鼠受精卵的原核；或利用該轉基因轉化胚胎干細胞。含有圖14A所示基因構建物的載體還可用于轉基因的瞬時轉染，該轉基因的啟動子和密碼子按宿主生物作了優(yōu)化。與圖14B和14C所示基因構建物相連的多核苷酸序列包括基因組整合功能區(qū)以促進此轉基因整合入病毒基因組和/或宿 主基因組。圖14D顯示了可用于產生穩(wěn)定細胞系的含嵌合蛋白基因構建物的載體。
權利要求
1.一種載體，其含有以下每一種元件，這些元件順次排列而形成模塊型開放讀框，所述載體包含: a)編碼第一組氨基酸的第一限制性位點，其中此第一組氨基酸包括至少兩個氨基酸； b)編碼感興趣多肽的第一開放讀框，其中此感興趣多肽的編碼序列與上述第一限制位點的至少兩個氨基酸的編碼序列同在框內； c)編碼第二組氨基酸的第二限制性位點，其中此第二組氨基酸包括至少兩個氨基酸，其中上述第二限制性位點的第二組氨基酸編碼序列與上述第一開放讀框的感興趣多肽編碼序列同在框內，其中上述第二限制性位點的多核苷酸序列與第一限制性位點的多核苷酸序列不同； d)間隔臂多核苷酸序 列，其中此間隔臂多核苷酸序列編碼至少3個間隔氨基酸，其中此間隔臂序列的編碼序列與上述第二限制性位點的多核苷酸序列同在框內；和 e)編碼第三組氨基酸的第三限制性位點，其中此第三組氨基酸包括至少兩個氨基酸，其中上述第三限制性位點的第三組氨基酸編碼序列與上述至少3個間隔氨基酸的編碼序列同在框內，其中上述第三限制性位點的多核苷酸序列與第一限制性位點的多核苷酸序列不同，并且第三限制性位點與第二限制性位點的多核苷酸序列不同； 其中元件(a)-(e)彼此同框相連從而形成模塊型開放讀框。
2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第一限制性位點易受限制性酶作用而產生含有至少2個核苷酸的第一單鏈突出端，所述第二限制性位點易受限制性酶作用而產生含有至少2個核苷酸的第二單鏈突出端，其中所述第一和第二突出端彼此互補，從而使所述第一和第二突出端在合適條件下能彼此退火。
3.如權利要求2所述的載體，其特征在于，所述第一限制性位點包含NgoMIV限制性酶識別的多核苷酸序列。
4.如權利要求2所述的載體，其特征在于，所述第二限制性位點包含XmaI限制性酶識別的多核苷酸序列。
5.如權利要求4所述的載體，其特征在于，所述第三限制性位點包含CIaI限制性酶識別的多核苷酸序列。
6.如權利要求1所述的載體，其特征在于，還包含與所述模塊型開放讀框的5’部分操作性相連的啟動子。
7.如權利要求6所述的載體，其特征在于，所述啟動子是哺乳動物啟動子。
8.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第一開放讀框與第二限制性位點之間插入了至少一個其它的開放讀框，其中此至少一個其它的開放讀框各自與所述第一開放讀框和第二限制性組同在框內，其中所述其它的開放讀框各自編碼至少一種其它的感興趣多肽。
9.如權利要求8所述的載體，其特征在于，所述載體包含至少兩個開放讀框。
10.如權利要求9所述的載體，其特征在于，所述載體包含至少3個開放讀框。
11.一種制備融合多肽的方法，包括， a)用識別第二和第三限制性位點的限制性酶消化權利要求6所述的載體，從而產生含有第一和第二單鏈突出端的線形載體，其中該第一和第二突出端彼此不相容； b)提供第一插入物,其中此第一插入物包含至少一個其它的開放讀框,其中此至少一個其它的開放讀框包含與所述第一和第二個突出端相容的5’和3’突出端，其中此至少一個其它的開放讀框各自編碼至少一個其它的感興趣多肽； c)將第一插入物連接入所述線形載體，從而形成連接的表達載體，其中所述至少一個開放讀框的5’突出端與所述線形載體的第一個單鏈突出端退火相連，其中所述至少一個開放讀框的3’突出端與所述線形載體的第二個單鏈突出端退火相連，所述3’突出端的連接重新產生第三限制性位點，其中所述至少一個其它的開放讀框與第一開放讀框彼此同框相連。
12.—種制備融合多肽的方法,包括: a)用識別第二和第三限制性位點的限制性酶消化如權利要求9所述的載體，從而產生含有第一和第二個單鏈突出端的線形載體，其中所述第一和第二突出端彼此不相容； b)提供第一插入物,其中此第一插入物包含至少一個其它的開放讀框,其中此至少一個其它的開放讀框包含與所述第一和第二個突出端相容的5’和3’突出端，其中此至少一個其它的開放讀框各自編碼至少一個其它的感興趣多肽； c)將第一插入物連接入所述線形載體，從而形成連接的表達載體，其中所述至少一個開放讀框的5’突出端與所述線形載體的第一個單鏈突出端退火相連，其中所述至少一個開放讀框的3’突出端與所述線形載體的第二個單鏈 突出端退火相連，其中所述3’突出端的連接重新產生第三限制性位點， 其中所述至少一個其它的開放讀框與第一開放讀框彼此同框相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備模塊型嵌合蛋白表達產物的方法以及用于所述方法的組合物。具體地說，本發(fā)明涉及順次、定向克隆編碼多肽模塊的多核苷酸。各可克隆元件或模塊含有側接預定的限制性位點的感興趣開放讀框。這些方法包括利用模塊和含有這些模塊的載體作為重組DNA技術的起始材料。本發(fā)明的優(yōu)點之一是能快速而方便地制備融合蛋白的許多變體，而無需設計和評估后續(xù)的各克隆步驟。
文檔編號C12N15/85GK103215294SQ20131007213
公開日2013年7月24日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權日2005年10月19日
發(fā)明者T·里德 申請人:英特瑞克斯頓股份有限公司