單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，所述試劑盒包括凍存管和PCR反應(yīng)管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F和凍存管G，所述凍存管A裝有用于PCR反應(yīng)的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制備的凍干粉，凍存管B裝有裂解液，凍存管C～凍存管F各自裝有一種單增李斯特菌主要血清型的陽性對(duì)照緩沖液，凍存管G裝有稀釋液；本發(fā)明試劑盒僅一步PCR反應(yīng)便可準(zhǔn)確、快速地鑒別單增李斯特菌全部4種主要血清型，該方法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，特異性與靈敏性好，靈敏性可達(dá)102CFU/mL，無交叉反應(yīng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠并簡(jiǎn)單易讀，適用于大通量的分型操作。
【專利說明】單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒及應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)菌性病原血清型的鑒別診斷，基于多重PCR方法，建立鑒定單增李斯特菌主要血清型的快速分型技術(shù)，即單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒及應(yīng)用方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是重要的人獸魚共患食源性病原菌,對(duì)環(huán)境耐受性強(qiáng)，可在較高的鹽濃度(10%NaCl)以及寬泛的pH (pH4.5~9)和溫度范圍(O~45°C)內(nèi)生長(zhǎng)，并可形成莢膜，因而單增李斯特菌廣泛存在于自然界(包括土壤、水源、植物及動(dòng)物體等)，易污染各種食品(肉、奶、海產(chǎn)品及蔬菜等)。單增李斯特菌可引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等，其致死率(20~30%)遠(yuǎn)高于其他常見食源性病原菌，如腸炎沙門氏菌(約0.38%)、彎曲桿菌(0.02~0.1%)、弧菌(0.005~0.1%)等。2000年即被WHO食品安全工作計(jì)劃列為檢測(cè)的食源性致病菌之一，其危害嚴(yán)重性可見一斑。
[0003]根據(jù)菌體/鞭毛抗原(0/H)的血清學(xué)反應(yīng)，單增李斯特菌可分為13個(gè)血清型，SPl/2a、l/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e 與 7 型。其中血清型 l/2a、l/2b、l/2c 與4b為主要血清型，占食品與病人分離株的99%以上；其他血清型則分離率極低。并非所有血清型均表現(xiàn)出相同的致病力。血清型l/2a在食品中分離率最高，但絕大多數(shù)暴發(fā)或散發(fā)的人侵襲型李斯特菌病病例由4b型引起，而胃腸炎型李斯特菌病病例多由l/2a型與l/2b型引起，其他血清型則鮮有引起人發(fā)病的案例。侵襲性李斯特菌病與胃腸炎李斯特菌病主要有如下差異:引發(fā)胃腸炎的污染食品攜帶菌量(pathogen load)大，發(fā)病急(18~27h),癥狀包括發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、 關(guān)節(jié)痛與頭痛等，感染者大多為健康人群；而侵襲性病例主要引發(fā)免疫力低下人群的致死性癥狀。腦膜炎病人的4b型分離率顯著高于一般患者，且4b型感染者的死亡率(26%)明顯高于其他血清型感染者(16%)，提示4b型可能具有更勝一籌的毒力。因此，亟需建立可鑒別單增李斯特菌各主要血清型的快速分型方法。
[0004]目前，單增李斯特菌的血清型分型主要為血清學(xué)方法，依賴于商品化的菌體與鞭毛抗原，不僅價(jià)格昂貴，且存在操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、交叉反應(yīng)多發(fā)、試驗(yàn)結(jié)果不易判讀等弊端，尤其不適用于大通量的分型操作。國內(nèi)外通過比較基因組學(xué)方法，陸續(xù)篩選出血清型特異的基因位點(diǎn)，但迄今尚無單增李斯特菌主要血清型的快速分型方法。本發(fā)明將通過對(duì)血清型特異基因的分析、引物與檢測(cè)條件的優(yōu)化，設(shè)計(jì)一種準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的多重PCR檢測(cè)試劑盒，以期填補(bǔ)上述的空白。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的單增李斯特菌主要血清型分型試劑盒及使用方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供一種單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，所述試劑盒包括凍存管和PCR反應(yīng)管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F和凍存管G，所述凍存管A裝有用于PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制備的凍干粉，凍存管B裝有裂解液，凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F分別裝有單增李斯特菌l/2a型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌l/2b型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌l/2c型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌4b型陽性對(duì)照緩沖液，凍存管G裝有稀釋液，所述稀釋液為高壓滅菌雙蒸水；所述陽性對(duì)照緩沖液為單增李斯特菌EGD-e (血清型l/2a)、單增李斯特菌54004 (血清型l/2b)、單增李斯特菌54002 (血清型l/2c)、單增李斯特菌ATCC19115 (血清型4b)分別接種在BHI培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，取菌液100°C煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用雙蒸水重懸，制成陽性對(duì)照緩沖液樣品；[0008]所述凍存管A中引物的序列為:
[0009]Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
[0010]Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG[0011 ] L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
[0012]L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC
[0013]L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
[0014]L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
[0015]L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
[0016]和L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。
[0017]進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)管根據(jù)待檢測(cè)樣品數(shù)量定，通常試劑盒內(nèi)所述PCR反應(yīng)管為100 ~300 個(gè)。
[0018]進(jìn)一步，優(yōu)選所述凍存管A內(nèi)的凍干粉是將混合液先在_80°C超低溫冰箱預(yù)凍10h，再放入凍干機(jī)(干燥箱壓力0.03MPa)，溫度設(shè)為_40°C (升華干燥階段)持續(xù)凍干30h，除去90%以上水分；之后溫度升至25°C進(jìn)行解析干燥2h (升溫速率為1.50C /min),使水分含量達(dá)到5% (質(zhì)量濃度)以下，獲得凍干粉；所述每8 μ L混合液組成為:Taq DNA聚合酶0.4 μ L，10 X buffer3 μ L, dNTP mixture (含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 IOmM) 0.6 μ L,濃度均為 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由終濃度均為IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP構(gòu)成。
[0019]進(jìn)一步，所述凍存管B中裂解液終濃度組成為:體積濃度4%Triton-X100，5mg/mL NaN3, lmol/L Tris，pHS8.0 (用IOM氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié))，溶劑為蒸餾水，配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (終濃度 5mg/mL) 500mg, Tris (終濃度 lmol/L) 12.114g，用 IOM 氫氧化鈉調(diào)pH至8.0,蒸懼水定容至100mL。
[0020]進(jìn)一步，優(yōu)選每個(gè)試劑盒有100個(gè)PCR反應(yīng)管，所述凍存管A內(nèi)凍干粉的量以凍干前混合液的體積計(jì)為800 μ L (滿足100個(gè)PCR反應(yīng)管的用量)，所述凍存管B內(nèi)裝有裂解液ImL,凍存管C~凍存管F各自裝有陽性對(duì)照緩沖液0.5mL，凍存管G裝有1.5mL稀釋液(通常凍存管G內(nèi)的稀釋液是一次性加入凍存管A，供100次PCR反應(yīng)用)，每支凍存管內(nèi)裝樣量根據(jù)PCR管個(gè)數(shù)定，凍存管A內(nèi)凍干粉的量以凍干前混合液體積計(jì)，混合液體積與凍存管G內(nèi)稀釋液體積比為8:15，每次PCR反應(yīng)需要稀釋液跟凍干粉混懸制備的混懸液15 μ L、凍存管B內(nèi)裂解液10 μ L、陽性對(duì)照緩沖液5 μ L或待檢樣品5 μ L。
[0021]本發(fā)明還提供一種利用所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒進(jìn)行單增李斯特菌主要血清型分型的方法，所述分型方法按如下步驟進(jìn)行:(I)將凍存管G中稀釋液加至凍存管A，重懸、混勻制成混懸液，存放于-20°C備用(PCR反應(yīng)前先在室溫下解凍)；所述凍干粉用量以凍干前混合液體積計(jì)，所述的凍存管G中稀釋液與混合液體積比為15:8 ；
[0022](2)將凍存管B中的裂解液分別加入PCR反應(yīng)管，分為對(duì)照PCR反應(yīng)管和待檢PCR反應(yīng)管，再依次將凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對(duì)照緩沖液加入相應(yīng)對(duì)照PCR反應(yīng)管內(nèi)，將待檢樣品加入待檢PCR反應(yīng)管，混合均勻，然后再向各個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入步驟(1)凍存管A內(nèi)的混懸液，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述待檢樣品為單增李斯特菌接種在BHI培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，取菌液100°C煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用高壓滅菌雙蒸水重懸，制成待檢樣品；所述凍存管B中裂解液與凍存管A中混懸液的體積比為2:3，所述凍存管B中裂解液與凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對(duì)照緩沖液的體積比均為2:1，所述凍存管B中裂解液與待檢樣品體積比為2:1 ;通常PCR反應(yīng)管內(nèi)裝有30 μ L反應(yīng)液，即凍存管A內(nèi)的混懸液15 μ L、凍存管B內(nèi)的裂解液10 μ L、對(duì)照液或樣品液5 μ L ;所述BHI培養(yǎng)基按BHI培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)配法，即3.7gBHI粉溶于IOOmL蒸餾水，高壓滅菌；
[0023](3)將步驟(2)各個(gè)PCR反應(yīng)管按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增:95°C預(yù)熱3min ;95°C變性 45s，55。。退火 30s，72。。延伸 55s, 25 個(gè)循環(huán)；72°C保持 5min ；
[0024](4)將步驟(3)擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別在質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)并記錄；
[0025](5)結(jié)果判定:檢測(cè)后，待檢樣品與凍存管C內(nèi)的陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出691bp條帶的為單增李斯特菌l/2a型陽性；待檢樣品與凍存管D內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出471bp條帶的為單增李斯特菌l/2b型陽性；待檢樣品與凍存管E內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出691bp、906bp兩條條帶`的為單增李斯特菌l/2c型陽性；待檢樣品與凍存管F內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出471bp、597bp兩條條帶的為單增李斯特菌4b型陽性；陽性對(duì)照溶液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為非單增李斯特菌主要血清型；待檢樣品與陽性對(duì)照溶液均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對(duì)照溶液無條帶的需重新檢測(cè)并判定。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供一種單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，該試劑盒僅一步PCR反應(yīng)便可準(zhǔn)確、快速地鑒別單增李斯特菌全部4種主要血清型。與基于血清凝集反應(yīng)的傳統(tǒng)血清型分型方法相比，該方法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，特異性與靈敏性好，靈敏性可達(dá)102CFU/mL，無交叉反應(yīng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠并簡(jiǎn)單易讀，適用于大通量的分型操作。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為凝膠電泳圖片，
[0028]A中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為血清型l/2a陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(l/2a型陽性)。
[0029]B中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為血清型l/2b陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(l/2b型陽性)。
[0030]C中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為血清型l/2c陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(l/2c型陽性)。[0031]D中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為血清型4b陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(4b型陽性)。
[0032]E中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為血清型l/2a陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0033]F中泳道M為2000bp DNALadder Marker,泳道I為血清型l/2b陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0034]G中泳道M為2000bp DNALadder Marker,泳道I為血清型l/2c陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0035]H中泳道M為2000bp DNALadder Marker,泳道I為血清型4b陽性對(duì)照品，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0036]I中泳道M為2000bp DNALadder Marker,泳道I為陽性對(duì)照品(未見條帶)，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0037]J中泳道M為2000bp DNALadder Marker,泳道I為陽性對(duì)照品(未見條帶)，泳道2為待檢樣品(陽性)。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0039]實(shí)施例1單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒
[0040]一、凍存管組成
[0041]A管為凍干粉，凍干粉含量以凍干前混合液體積計(jì)，供100次PCR反應(yīng)的混合液為800 μ L,每 8 μ L 混合液由 Taq DNA polymerase (市購)0.4 μ L, IOXbuffer (市購)3uL,dNTP mixture0.6 μ L (市購，dATP、dCTP、dGTP和dTTP終濃度均為IOmM),引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)Ll-F, Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F、L4-R 各 0.5 μ L (各條引物濃度均為50 μ Μ)組成；凍干粉的制備是先將混合液在_80°C超低溫冰箱預(yù)凍IOh ;再放入凍干機(jī)(干燥箱壓力0.03MPa)，溫度設(shè)為-40°C (升華干燥階段)持續(xù)凍干30h，除去90%以上水分；之后溫度升至25°C進(jìn)行解析干燥2h (升溫速率為1.5°C /min)，使水分含量達(dá)到5%以下，制得凍干粉，保存于_20°C。
[0042]B 管裝有 ImL 裂解液，配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (終濃度 5mg/mL) 500mg,Tris (終濃度lmol/L) 12.114g,用IOM氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至8.0,蒸懼水定容至IOOmL,保存于_20°C。
[0043]C-F管各自裝有0.5mL溶液，為4種陽性對(duì)照品(單增李斯特菌l/2a型、l/2b型、l/2c型和4b型陽性對(duì)照緩沖液)，保存于_20°C。
[0044]G管含有1.5mL溶液，為稀釋液(即高壓滅菌雙蒸水)，保存于4°C。
[0045]引物序列:
[0046]Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
[0047]Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG
[0048]L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
[0049]L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC[0050]L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
[0051]L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
[0052]L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
[0053]L4-R: CGGCTTGTTCGGCATACTTA
[0054]PCR 反應(yīng)管 100 個(gè)。
[0055]二、加樣及檢測(cè)步驟說明
[0056](I)將凍存管G中1.5mL稀釋液加至凍存管A (凍存管A內(nèi)混合液凍干前體積為800 μ L),重懸、混勻制成混懸液,存放于-20°C備用；
[0057](2)將凍存管B中的裂解液10 μ L分別加入5個(gè)(每管10 μ L裂解液)PCR反應(yīng)管，分為對(duì)照PCR反應(yīng)管C-F和待檢PCR反應(yīng)管，再將凍存管C-F中的陽性對(duì)照溶液5 μ L分別加入對(duì)照PCR反應(yīng)管C-F中，將待檢樣品5 μ L加至待檢PCR反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，然后將步驟(I)凍存管A中的混懸液15 μ L分別加入上述對(duì)照PCR反應(yīng)管C-F和待檢PCR反應(yīng)管，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0058](3)將PCR反應(yīng)管按以下反應(yīng)條件在PCR儀(Life Technologies，Veriti)上進(jìn)行擴(kuò)增:95°C 3min ；95°C 45s, 55°C 30s, 72°C 55s，25 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ；
[0059](4)將擴(kuò)增后的產(chǎn)物在質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠、0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色(市購)后用凝 膠成像系統(tǒng)(上海天能4500SF)讀取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。
[0060]實(shí)施例2單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒及應(yīng)用
[0061]下面通過試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的使用效果進(jìn)行論證和描述。
[0062]I材料與方法
[0063]1.1菌株及培養(yǎng)
[0064]將134株單增李斯特菌(分離來源見表1)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)選擇性顯色培養(yǎng)基(CHROM agar,法國科瑪嘉)與Vitek (法國梅里埃)方法進(jìn)行菌種確證,均為單增李斯特菌，為便于實(shí)驗(yàn)將除參考株外的各個(gè)菌株進(jìn)行編號(hào)(詳見表1，M4至SH4行、Ml至SH3行、M9至NB28行、M5至125SL1行、M7至Wl-1ll行)。與單增李斯特菌親緣關(guān)系較近、G + C含量低的革蘭氏陽性菌(G+1ot)如無害李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii )、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri )、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、臘樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus, equi subsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)以及其他12種陰性對(duì)照菌株嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)、福氏志賀氏菌(Shigella fIexneri)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、支氣管敗血博代氏菌(Bordetellabronchis印tica)亦由本實(shí)驗(yàn)室保存(詳見表1)。各菌株接種于5mL BHI (DIFCO)培養(yǎng)基(Oxoid, Hampshire, England), 37°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0065]1.2基于血清學(xué)方法的血清分型
[0066]經(jīng)基于菌體/鞭毛抗原(0/H)與抗血清的凝集反應(yīng)，對(duì)所有單增李斯特菌菌株進(jìn)行傳統(tǒng)血清型分型。134株單增李斯特菌中含有l(wèi)/2a型菌株50株，l/2b型菌株29株，l/2c型菌株17株，4b型菌株26株，4a型菌株10株，4c型菌株2株(詳見表1)。
[0067]1.3PCR體系建立
[0068]1.3.1引物篩選
[0069]采用比較基因組學(xué)方法，并參照相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)血清型特異的基因區(qū)域內(nèi)保守區(qū)和可變區(qū)進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)8條引物L(fēng)l-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3_F、L3-R、L4_F、L4-R。弓丨物序列詳見表2。
[0070]1.3.2PCR反應(yīng)體系及條件
[0071]通過PCR體系及條件的優(yōu)化，確定多重PCR反應(yīng)體系(ddH20為稀釋液)為:IOXTaq Buffer (含 Mg2 + ) 3 μ L，10mmol/L dNTP Mix0.6 μ L，50 μ M 引物各 0.5 μ L，Taq DNApolymerase0.4 μ L，陽性對(duì)照溶液5 μ L或待檢樣品5 μ L，裂解液10 μ L，加ddH20補(bǔ)足體積至 30 μ L ;反應(yīng)條件為:95°C 3min ；95°C 45s, 55°C 30s, 72°C 55s, 25 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠0.5 X TBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。
[0072]1.3.3PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定
[0073]將PCR產(chǎn)物割膠回`收，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5 α，提取質(zhì)粒后鑒定，陽性克隆子送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。序列經(jīng)NCBI BLAST對(duì)比，以確證片段為目的條帶。
[0074]1.3.4特異性試驗(yàn)
[0075]以無害李斯特菌(Listeriainnocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)> 豬鏈球菌(Streptococcus suis)、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus, equisubsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(VibrioparahaemoIytiCUs)> 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)、福氏志賀氏菌(Shigella fIexneri)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、支氣管敗血博代氏菌(Bordetella bronchiseptica) 25種細(xì)菌作為陰性對(duì)照，雙蒸水為空白對(duì)照，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。ATCC為美國典型微生物保藏中心；CMCC為中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，地址為北京市天壇西里2號(hào)。
[0076]表1李斯特菌參考菌株及陰性對(duì)照菌株
【權(quán)利要求】
1.一種單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括凍存管和PCR反應(yīng)管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F和凍存管G，所述凍存管A裝有用于PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制備的凍干粉，凍存管B裝有裂解液，凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F分別裝有單增李斯特菌l/2a型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌l/2b型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌l/2c型陽性對(duì)照緩沖液、單增李斯特菌4b型陽性對(duì)照緩沖液，凍存管G裝有稀釋液，所述稀釋液為雙蒸水；所述凍存管A中引物的序列為:
Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG
L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC
L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
和 L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。
2.如權(quán)利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)管為100~300個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述凍存管A內(nèi)的凍干粉是將凍存管A內(nèi)所述混合液先在_80°C預(yù)凍10h，再在_40°C持續(xù)凍干30h，然后以1.5°C /min的速率升溫至25°C干燥2h使水分含量達(dá)到5%以下，獲得凍干粉；所述每8 μ L 混合液組成為:Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L，10 Xbuffer3 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,濃度均為 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由終濃度均為IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP構(gòu)成。
4.如權(quán)利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于凍存管B中所述裂解液終濃度組成為:體積濃度4%Triton-X100, 5mg/mLNaN3, lmol/L Tris, pH為8.0，溶劑為蒸餾水。
5.如權(quán)利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于每個(gè)試劑盒有100個(gè)PCR反應(yīng)管，所述凍存管A內(nèi)凍干粉的量以凍干前混合液的體積計(jì)為800 μ L，所述凍存管B內(nèi)裝有裂解液lmL，凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F各自裝有陽性對(duì)照緩沖液0.5mL,凍存管G裝有1.5mL稀釋液。
6.一種利用權(quán)利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒進(jìn)行單增李斯特菌主要血清型分型的方法，其特征在于所述分型方法按如下步驟進(jìn)行:(I)將凍存管G中稀釋液加至凍存管A，重懸、混勻制成混懸液，存放于-20°C備用；所述凍干粉用量以凍干前混合液體積計(jì)，所述的凍存管G中稀釋液與混合液體積比為15:8 ; (2)將凍存管B中的裂解液分別加入PCR反應(yīng)管，分為對(duì)照PCR反應(yīng)管和待檢PCR反應(yīng)管，再依次將凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對(duì)照緩沖液加入相應(yīng)對(duì)照PCR反應(yīng)管內(nèi)，將待檢樣品加入待檢PCR反應(yīng)管，分別混合均勻，然后再向各個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入步驟(1)凍存管A內(nèi)的混懸液，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述待檢樣品為待檢的單增李斯特菌接種在BHI培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，取菌液10(TC煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用雙蒸水重懸，制成待檢樣品；所述凍存管B中裂解液與凍存管A中混懸液的體積比為2:3，所述凍存管B中裂解液與凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對(duì)照緩沖液的體積比均為2:1，所述凍存管B中裂解液與待檢樣品體積比為2:1; (3)將步驟(2)各個(gè)PCR反應(yīng)管按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增:95°C預(yù)熱3min；95°C變性 45s，55°C退火 30s，72。。延伸 55s，25 個(gè)循環(huán);72°C保持 5min ； (4)將步驟(3)擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別在質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5XTBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)并記錄； (5)結(jié)果判定:檢測(cè)后，待檢樣品與凍存管C內(nèi)的陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出691bp條帶的為單增李斯特菌l/2a型陽性；待檢樣品與凍存管D內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出471bp條帶的為單增李斯特菌l/2b型陽性；待檢樣品與凍存管E內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出691bp、906bp兩條條帶的為單增李斯特菌l/2c型陽性；待檢樣品與凍存管F內(nèi)陽性對(duì)照溶液同時(shí)擴(kuò)增出471bp、597bp兩條條帶的為單增李斯特菌4b型陽性；陽性對(duì)照溶液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為非單增李斯特菌主要血清型；待檢樣品與陽性對(duì)照溶液均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對(duì)照溶液無條帶的需重新檢測(cè)并判定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602739SQ201310571311
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】陳健舜 申請(qǐng)人:浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站