一種miR-26a抑制劑及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于分子生物學microRNA技術領域，涉及一種miR-26a抑制劑及其用于制 備治療肺癌藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 肺癌死亡率居全世界癌癥死亡之首。世界范圍內(nèi)，大約80-85%的病例為非小細胞 肺癌(NSCLC)，非小細胞肺癌包括鱗狀細胞癌（SCC)，腺癌(ADC)和大細胞癌(LCC)。盡管手 術、放化療及分子靶向治療在臨床上已經(jīng)廣泛應用，但是晚期非小細胞肺癌的生存期短，病 死率仍舊很高。
[0003] microRNA是非編碼小RNA，在轉錄后水平調(diào)節(jié)與其相對應靶基因的表達。隨著實驗 研究的深入，發(fā)現(xiàn)microRNA參與調(diào)節(jié)人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中miR-26a與非小細胞肺 癌生長以及EGFR-TKIs耐藥的關系引起越來越多的關注。闡明miR-26a在非小細胞肺癌中的 作用將有助于新藥研發(fā)和個體化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織較正常癌旁組織miR_26a的表達顯著升高;肺腺癌細 胞系SPCAl、PC-9、H2170、SW900中miR-26a的表達較正常支氣管上皮細胞BEAS-2B顯著升高。 PTPN13是已知的抑癌基因，miR-26a通過轉錄后調(diào)控抑制PTPN13的表達而發(fā)揮促進非小細 胞肺癌生長的作用。研究發(fā)現(xiàn)PTPN13通過去磷酸化Src而抑制EGFR信號通路，PTPN13的高表 達可增強肺癌細胞對EGFR-TKIs的敏感性，因此，miR-26a抑制劑不僅具有抑制肺癌生長的 作用，而且可以提高耐藥肺癌細胞對EGFR-TKIs的敏感性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a抑制劑 通過轉染試劑轉染入細胞后具有抑制miR-26a表達的作用，對于miR-26a表達高的肺癌細 胞，在抑制miR-26a表達后，可以抑制肺癌細胞的生長，并且增加肺癌細胞對EGFR-TKIs的敏 感性。
[0005] 本發(fā)明提供了一種miR-26a抑制劑。
[0006] 本發(fā)明所提供的miR-26a抑制劑核酸序列為AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。
[0007] 本發(fā)明還提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA用于促進抑癌基因 PTPN13表達的應用。
[0008] 本發(fā)明同時還提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA用于制備治療肺 癌藥物的應用。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA與吉非替尼聯(lián)合 用于制備治療肺癌藥物的應用。
[0010] 本發(fā)明的miR-26a抑制劑抑制肺癌中miR-26a從而間接性解除miR-26a對抑癌基因 PTPN13的抑制作用，達到抑制肺癌生長的目的；同時本發(fā)明的miR-26a抑制劑具有吉非替尼 治療肺癌的增敏作用。
[0011] l.miR-26a抑制劑合成:miR-26a抑制劑是化學合成的類似miR-26a反義序列的RNA 或DNA〇根據(jù)本發(fā)明所述的miR-26a序列UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU CCUAUCCUGGAUUA⑶UGAAUU，采用寡核苷酸生物合成技術，分別合成多個miR-26a抑制劑，通 過轉染試劑轉染入SPCA1細胞后，采用qRT-PCR的方法檢測miR_26a的表達，選擇抑制效率最 高的miR-26a抑制序列:AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0012] 2. miR_26a在肺腺癌組織及肺腺癌細胞系中的表達異常增高:采用qRT-PCR的方法 檢測了 5對肺腺癌及其癌旁組織和6株非小細胞肺癌細胞系A549、SPCA1、PC-9、H2170、 SW900、H520中miR-26a的表達水平（以正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B作為對照）。結果發(fā) 現(xiàn)，肺腺癌組織及非小細胞肺癌細胞系A549、SPCA1和SW900中miR-26a表達較BEAS-2B細胞 顯著升高，細胞系PC-9、H2170和H520中miR-26a表達與MAS-2B細胞無顯著差異（圖1)。 A549、SPCA1 和 SW900 為 EGFR-TKIs 耐藥細胞系，而 PC-9、H2170 和 H520 為 EGFR-TKIs 敏感細胞 系，提示miR_26a高表達可能與肺癌EGFR-TKIs耐藥有關。
[0013] 3.miR-26a促進肺癌細胞生長，miR-26a抑制劑增強EGFR-TKIs耐藥細胞對TKIs的 敏感性:MTS生長實驗發(fā)現(xiàn)在高表達miR-26a的SPCA1細胞中加入miR-26a抑制劑可抑制細胞 生長;在低表達miR-26a的PC-9細胞中加入miR-26a可促進細胞生長。進一步MTS研究發(fā)現(xiàn)應 用miR-26a抑制劑于吉非替尼耐藥的SPCA1細胞，可增強SPCA1細胞對吉非替尼的敏感性;而 將miR-26a mimics應用于吉非替尼敏感的PC-9細胞中，可減弱PC-9細胞對吉非替尼的敏感 性（圖2、3)。
[0014] 4.miR-26a抑制PTPN13的表達：生物信息學預測發(fā)現(xiàn)PTPN13 3'UTR有miR-26a的調(diào) 控序列。在PTPN13低表達的SPCA1細胞中，miR-26a抑制劑可促進SPCA1細胞PTPN13的mRNA表 達和蛋白表達。在PTPN13高表達的PC-9細胞中，miR-26a mimics可抑制PC-9細胞PTPN13的 蛋白表達。構建包含PTPN133'UTR的質粒，將miR-26a mimics與該質粒共轉染于HEK293細胞 中，熒光素酶基因實驗證實miR_26a可以抑制PTPN13的表達PTPN13 3'UTR突變的質粒則無 相應改變(圖4)。
[0015] 5.PTPN13靶向p-Src使其脫磷酸化。miR-26a靶向PTPN13,而PTPN13必須調(diào)控EGFR 信號通路才能發(fā)揮TKIs增敏的作用。免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號通路中的Src可與 PTPN13結合。PTPN13是磷脂酶，與Src結合可發(fā)揮磷脂酶去磷酸化的作用。生物信息學計算 發(fā)現(xiàn)PTPN13-Sr CpTyi416復合物的時間空間穩(wěn)定性良好，并且PTPN13-Src復合物的結合位點 正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位點。在H520細胞中基因沉默PTPN13后Src pTyl:416的 磷酸化水平顯著提高（圖5)。
[0016] 6.miR-26a antagomir聯(lián)合吉非替尼可使SPCA1細胞的肺移植瘤體積、重量明顯縮 小（圖6)。移植瘤小鼠分4組:對照組，吉非替尼組，miR-26a antagomir瘤內(nèi)注射組和吉非替 尼灌胃聯(lián)合miR-26a antagomir瘤內(nèi)注射組。miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫瘤體積和重 量縮小最明顯。
【附圖說明】
[0017]圖l.miR_26a在肺癌組織與細胞系中的表達差異;A.qRT-PCR法檢測5對非小細胞 肺癌及其癌旁正常組織中miR_26a的表達水平；B . qRT-PCR法檢測正常支氣管上皮細胞 BEAS-2B和6種非小細胞肺癌細胞系中miR-26a的表達水平。
[0018]圖2.miR-26a在吉非替尼耐藥的SPCA1腺癌細胞系中的作用;A.miR-26a聯(lián)合吉非 替尼可顯著抑制SPCA1細胞的生長;B.miR-26a抑制劑(miR-26a antagomir)可增加SPCA1細 胞對吉非替尼的敏感性。
[0019] 圖3.miR-26a在吉非替尼敏感的PC-9肺腺癌細胞系中的作用;A.miR-26a mimics 可促進PC-9細胞的生長;B.miR_26a mimics可降低PC-9細胞對吉非替尼的敏感性。
[0020] 圖4.miR-26a抑制PTPN13的表達；A.PTPN13的3'端存在miR-26a的調(diào)控序列； B. miR-26a抑制劑可促進SPCA1細胞PTPN13的mRNA表達;C .miR-26a抑制劑可促進SPCA1細胞 PTPN13的蛋白表達;D.miR-26a mimics可抑制PC-9細胞PTPN13的蛋白表達;E.PTPN13的3' UTR及其突變質粒共轉染于HEK93細胞中后熒光素酶報告質粒檢測。
[0021] 圖 5.PTPN13 靶向 p-Src 使其脫磷酸化；A. IP Src 可結合 ΡΤΡΝ13;Β·ΡΤΡΝ13-SrcpTyr416復合物的時間空間穩(wěn)定性好;C.PTPN13-SrcpTyr416復合物的相互作用位點分 析;D.基因沉默PTPN13后Src的磷酸化水平顯著提高。
[0022]圖6.裸鼠SPCA1細胞移植瘤實驗腫瘤生長變化;移植瘤小鼠分4組:對照組，吉非替 尼組，miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射組和吉非替尼灌胃聯(lián)合miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射 組。A.miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫瘤體積最小;B.miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫 瘤重量最小。
【具體實施方式】
[0023] l.miR-26a抑制劑合成
[0024] 根據(jù)miR-26a序列UUCAAGUAAUCC AGGAUAGGCUCCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU，采用寡核 苷酸生物合成技術，分別合成多個miR_26a反義寡核苷酸，通過轉染試劑轉染入SPCA1細胞 后，采用qRT-PCR的方法檢測miR_26a的表達，選擇抑制效率最高的miR_26a抑制序列： AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0025] 2 .qRT-PCR 檢測 miR_26a 的表達
[0026] 非小細胞肺癌組織以及與其相對應的癌旁正常肺組織均取自手術標本，組織樣本 由手術醫(yī)師取出后立即置于之前已經(jīng)準備好的液氮罐中保存。BEAS-2B、SW900、H2170、H520 細胞系均購自于六了〇：4549、3?041、？(：-9均由第四軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室 提供，A549細胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，BEAS-2B、SPCA1、PC-9、 SW900、H2170、H520均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)的改良型1640培養(yǎng)基中。采用TRIzol method(Life Technologies)提取非小細胞肺癌、癌旁組織、正常肺上皮細胞、肺癌細胞總 RNA，米用miScript Reverse Transcription Kit反轉為cDNA，米用qRT-PCR檢測miR_26a的 表達。
[0027] 3.細胞轉染miR-26a抑制劑或mimics后MTS實驗檢測細胞增殖水平
[0028] SPCA1 細胞轉染microRNA antagomir NC(對照）與人miR26a抑制劑（miR26a antagomir)，PC_9細胞轉染microRNA antagomir NC與人miR26a mimics。以SPCA1 或PC-9細 胞鋪6孔板，8-12小時觀察細胞匯合度達70%，細胞狀態(tài)良好。用400ul無血清1640分別稀釋 20ul antagomir NC，人miR26a antagomir、人miR26a mimics。輕混轉染試劑，并吸取6ul (每孔）加入稀釋的antagomir NC、人miR26a antagomir、人miR26a mimics中，用移液器混 勾靜置20min。每孔中加入400ul的microRNA-轉染試劑混合物(逐滴加入），輕搖6孔板混勾。 根據(jù)需要再分別加入吉非替尼15μΜ，于37°C，5%C0 2孵育箱孵育48小時后行MTS實驗。
[0029] (1)觀察細胞生長狀態(tài)良好，以0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化收集細胞，根據(jù)實驗要求 計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果將細胞濃度調(diào)至8X104/ml，移液器輕混勻細胞懸液后，取lOOul 分別加到到96孔板中，注意邊緣用無菌PBS填充，對照組加lOOul培養(yǎng)基。
[0030] (2)置37°C，5%二氧化碳孵育箱孵育4小時，倒置顯微鏡下觀察。
[0031] (3)每孔加入20ulMTS液(PMS50ul+MTS液lml)，37Γ孵育3小時。
[0032] (4)測定490nm各孔吸光值，0、24、48、72、96小時重復上述實驗。
[0033] (5)同時設置空白孔(培養(yǎng)基和MTS液，無細胞），對照孔(不加處理培養(yǎng)基和MTS液， 有細胞），每組設3個復孔。
[0034] 4.miR-26a 抑制 PTPN13 的表達
[0035] (1)生物信息學預測PTPN13 3'UTR有miR-26a的調(diào)控序列。
[0036] (2)在PTPN13低表達的SPCA1細胞中，采用qRT-PCR方法檢測miR_26a抑制劑對 PTPN13的mRNA表達的影響。
[0037] (3)在PTPN13低表達的SPCA1細胞中，采用Western-blot方法檢測miR-26a抑制劑 對PTPN13蛋白表達的影響。
[0038] (4)在PTPN13高表達的PC-9細胞中，米用Western-blot方法檢測miR_26a mimics 對PTPN13蛋白表達的影響。
[0039] (5)構建包含PTPN13 3'UTR的質粒，將miR-26a mimics與該質粒共轉染于HEK293 細胞中，熒光素酶基因實驗證實miR_26a可以抑制PTPN13的表達。PTPN13 3'UTR突變的質粒 則無相應改變。具體方法如下：
[0040] 以BEAS-2B基因組DNA為模板，前述生工所合成PTPN13 3'UTR引物為引物行PCR后 瓊脂糖凝膠電泳見612出白色光亮條帶，拍照后以帶酶切位點（EcoRI、PstI)引物行50ul體 系PCR后膠回收光亮區(qū)，并與雙酶切膠回收的SV40-PGL3basic載體連接后行轉化、挑克隆后 置于含有氨芐的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床振搖孵育16小時行菌液為模板PCR，以含有光亮區(qū)的 菌液加含有氨芐的LB5ml37°C搖床振搖孵育16小時后提取質粒，定量后行雙酶切鑒定。
[0041 ] 以HEK293細胞鋪24孔板，10小時后觀察細胞均勻，匯合度達70%，將PTPN133 'UTR-612野生型質粒及PTPN13 3'UTR突變質粒與miR-26a共轉染于HEK293細胞中，48小時后行熒 光素酶報告基因實驗，每組設5個復孔，結果發(fā)現(xiàn)轉染了 PTPN13野生型miR-26a組 Luc i f eras e較對照組明顯下降，說明為miR_26a可以革巴向作用于PTPN13。
[0042] 5.PTPN13靶向p-Src使其脫磷酸化
[0043] (1)采用anti-Src抗體做免疫共沉淀，采用anti-PTPN13抗體做Western-blot，發(fā) 現(xiàn)EGFR信號通路中的Src可與PTPN13結合。
[0044] (2)采用生物信息學計算研究發(fā)現(xiàn)PTPN13-SrcpTyl:416復合物的時間空間穩(wěn)定性良 好，并且PTPN13-Src復合物的結合位點正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位點。
[0045] (3)采用基因沉默技術在H520細胞中靶向沉默PTPN13的表達，采用Western-blot 技術檢測Src ρΤ〃416的磷酸化水平。
[0046] 6.裸鼠移植瘤實驗檢測SPCA1細胞移植瘤的生長
[0047]采用SPCA1細胞皮下注射法做裸鼠移植瘤實驗，實驗分為如下4組：
[0048] (1 )NC組(僅接種SPCA1瘤細胞的裸鼠）；
[0049] (2)吉非替尼灌胃組；
[0050] (3)miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射組；
[0051 ] (4)miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射聯(lián)合吉非替尼灌胃組。
[0052]人肺癌細胞SPCA1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，其中加入含100IU/ml 青霉素及l(fā)〇〇IU/ml鏈霉素的雙抗100ul/100ml，培養(yǎng)于37°C，5%二氧化碳孵育箱中，細胞培 養(yǎng)傳達狀態(tài)良好，消化離心PBS清洗收集(去除二抗影響），細胞以1 X 1071半小時內(nèi)接種于裸 鼠腋下，每組設5只，約4-5天可見移植瘤長出，待腫瘤長至約100mm 3時進行實驗，吉非替尼 組以吉非替尼灌胃（25mg/kg/day)，miR_26a抑制劑組予miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射(40ug 多點注射，2次/周），吉非替尼及miR-26a抑制劑共同作用組上述吉非替尼灌胃及miR-26a抑 制劑瘤內(nèi)注射同時進行;每3天以游標卡尺測量瘤體積大小，按公式V=(寬 2 X長度/2)計算 移植瘤體積。
[0053] 所有實驗結果均取均數(shù)土標準差表示，以SPSS13.0軟件進行處理，采用配 對t檢驗或單因素方差分析。統(tǒng)計結果P<0.05定為具有統(tǒng)計學意義。
【主權項】
1. 一種 miR-26a 抑制劑，該 miR-26a 抑制劑核酸序列為 AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。2. 權利要求1所述miR-26a抑制劑用于促進抑癌基因 PTPN13表達的應用。3. 權利要求1所述miR-26a抑制劑用于制備治療肺癌藥物的應用。4. 權利要求1所述miR-26a抑制劑與吉非替尼聯(lián)合用于制備治療肺癌藥物的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miR?26a抑制劑及其應用。所提供的miR?26a抑制劑核酸序列為AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。所提供的應用包括miR?26a抑制劑用于促進抑癌基因PTPN13表達的應用；miR?26a抑制劑用于制備治療肺癌藥物的應用；miR?26a抑制劑：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA與吉非替尼聯(lián)合用于制備治療肺癌藥物的應用。本發(fā)明的miR?26a抑制劑抑制肺癌中miR?26a的表達從而間接性解除miR?26a對抑癌基因PTPN13的抑制作用，達到抑制肺癌生長的目的；同時本發(fā)明的miR?26a抑制劑具有吉非替尼治療肺癌的增敏作用。
【IPC分類】A61K31/5377, A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/00
【公開號】CN105709240
【申請?zhí)枴緾N201610167807
【發(fā)明人】李圣青, 許淑娣, 楊志偉, 王濤, 賈林濤, 張勝利
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學