本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別是測(cè)定含黑色素的細(xì)胞的活率和密度的分析方法，以及相關(guān)用途。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞治療已經(jīng)成為一種非常有前景的治療手段，在臨床應(yīng)用方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度是評(píng)價(jià)細(xì)胞治療產(chǎn)品的基礎(chǔ)和重要指標(biāo)。因此，需要建立準(zhǔn)確的細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度檢測(cè)方法，并建立產(chǎn)品的放行標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)細(xì)胞活率的常用方法包括化學(xué)染色法和熒光染色法。化學(xué)染色法直接利用死細(xì)胞和活細(xì)胞對(duì)染料的不同親和力檢查細(xì)胞活率，能在光學(xué)顯微鏡下觀察到染色結(jié)果。臺(tái)盼藍(lán)染色法是最常用的化學(xué)染色法，其中使用臺(tái)盼藍(lán)染料對(duì)死細(xì)胞著色，當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的dna結(jié)合，使其著色。熒光染色法是根據(jù)死細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)熒光染料的通透性不同，通過(guò)熒光成像分辨死、活細(xì)胞，例如碘化丙啶(pi)，無(wú)法透過(guò)完整細(xì)胞膜，但能穿透正在死亡或已經(jīng)死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此活細(xì)胞不被染料上色，只有死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞才能被染上紅色；吖啶橙(ao)具有細(xì)胞膜透過(guò)性，能透過(guò)質(zhì)膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核dna，使之發(fā)出明亮的綠色熒光，無(wú)論活細(xì)胞還是死細(xì)胞均可以被著色。

2、目前在行業(yè)內(nèi)普遍使用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活率和細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)于含有色素顆粒的細(xì)胞，尤其是視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞，形態(tài)上呈現(xiàn)黑褐色，細(xì)胞無(wú)論是否加入臺(tái)盼藍(lán)染色，都會(huì)被檢測(cè)儀器識(shí)別為著色細(xì)胞，誤認(rèn)為是死細(xì)胞，造成檢測(cè)不準(zhǔn)確。但這樣的檢測(cè)方法仍然在諸多文獻(xiàn)和相關(guān)臨床研究細(xì)胞產(chǎn)品中使用。利用ao/pi方法來(lái)區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，理論上可規(guī)避臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)方法不準(zhǔn)確，但在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，這類細(xì)胞中的色素沉積也會(huì)干擾儀器對(duì)熒光信號(hào)的分辨，難以在常規(guī)條件下實(shí)現(xiàn)檢測(cè)準(zhǔn)確性。

3、考慮到當(dāng)前細(xì)胞藥物開發(fā)的需要，特別是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞這類帶有色素的細(xì)胞產(chǎn)品，在臨床上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，亟需開發(fā)可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的檢測(cè)方法，以便于檢測(cè)、放行和臨床給藥配伍等進(jìn)一步應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)含黑色素細(xì)胞的方法，其包括：

2、(a)將所述細(xì)胞的懸液用吖啶橙(ao)和碘化丙啶(pi)雙染色；和

3、(b)使用細(xì)胞熒光分析儀通過(guò)熒光分析確定所述懸液中的活細(xì)胞，其中將所述細(xì)胞熒光分析儀的曝光時(shí)間設(shè)為約1500ms-2000ms、明場(chǎng)pre_grathres參數(shù)設(shè)為約2-7、綠色熒光場(chǎng)flou_filter參數(shù)設(shè)為約6-10、綠色熒光場(chǎng)min_area參數(shù)設(shè)為約10-20。

4、在一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)含黑色素細(xì)胞的方法，其包括：

5、(a)將所述細(xì)胞的懸液用吖啶橙(ao)和碘化丙啶(pi)雙染色；和

6、(b)使用細(xì)胞熒光分析儀通過(guò)熒光分析確定所述懸液中的活細(xì)胞，其中對(duì)所述細(xì)胞熒光分析儀進(jìn)行以下設(shè)置：

7、曝光時(shí)間設(shè)為約1400-1600ms、明場(chǎng)pre_grathres參數(shù)設(shè)為約6-8、綠色熒光場(chǎng)flou_filter參數(shù)設(shè)為約5-7，綠色熒光場(chǎng)min_area參數(shù)設(shè)為約9-11；或

8、曝光時(shí)間設(shè)為約1900-2100ms、明場(chǎng)pre_grathres參數(shù)設(shè)為約1-3、綠色熒光場(chǎng)flou_filter參數(shù)設(shè)為約7-9，綠色熒光場(chǎng)min_area參數(shù)設(shè)為約19-21。

9、在一些實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞熒光分析儀的曝光時(shí)間設(shè)為1500ms、明場(chǎng)pre_grathres參數(shù)設(shè)為7、綠色熒光場(chǎng)flou_filter參數(shù)設(shè)為6和綠色熒光場(chǎng)min_area參數(shù)設(shè)為10，或者

10、將曝光時(shí)間設(shè)為2000ms、明場(chǎng)pre_grathres參數(shù)設(shè)為2、綠色熒光場(chǎng)flou_filter參數(shù)設(shè)為8和綠色熒光場(chǎng)min_area參數(shù)設(shè)為20。

11、在一些實(shí)施方案中，所述含黑色素的細(xì)胞是視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞。

12、在一些實(shí)施方案中，所述rpe細(xì)胞是自然分化、誘導(dǎo)分化或分離得到的人源或非人源的rpe細(xì)胞。

13、在一些實(shí)施方案中，所述rpe細(xì)胞是通過(guò)人胚干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化得到的。

14、在一些實(shí)施方案中，所述黑色素瘤細(xì)胞來(lái)源于患有黑色素瘤的患者的器官、組織或體液。所述黑色素瘤細(xì)胞可以在治療方案/方法施用之前和/或之后從所述患者獲得。

15、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞的懸液通過(guò)將所述細(xì)胞在稀釋液例如乳酸鈉林格注射液或生理鹽水溶液中稀釋而制備，任選地在步驟(a)之前所述細(xì)胞的懸液經(jīng)過(guò)一次或多次稀釋。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為約4.00×105-9.00×106個(gè)/ml，例如約5.00×105-8.00×106個(gè)/ml。

16、在一些實(shí)施方案中，在步驟(a)中將等體積的懸液和ao/pi試劑(即ao和pi試劑的混合物)混勻。

17、在一些實(shí)施方案中，所述方法測(cè)定所述懸液中的細(xì)胞活率和細(xì)胞密度。

18、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞熒光分析儀為rigel?s2、s3或s5全自動(dòng)細(xì)胞熒光分析儀、countstar?mira?fl?plus或countstar?mira?fl?plus細(xì)胞熒光分析儀。

19、在一些實(shí)施方案中，在將所述rpe細(xì)胞用于藥物制備或臨床給藥之前進(jìn)行所述方法。

20、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本文公開的任一種方法來(lái)評(píng)估藥物質(zhì)量的方法，其中所述藥物包含待檢測(cè)其活率或活細(xì)胞密度水平的rpe細(xì)胞。所述藥物可用于治療視網(wǎng)膜變性疾病，例如年齡相關(guān)性黃斑變性或視網(wǎng)膜色素變性。所述方法可進(jìn)一步包括基于通過(guò)所述方法測(cè)定的所述藥物中rpe細(xì)胞的活率判斷所述藥物質(zhì)量是否合格。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)含黑色素的細(xì)胞的方法，其包括：

2.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述細(xì)胞熒光分析儀進(jìn)行以下設(shè)置：

3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含黑色素的細(xì)胞是視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞。

4.權(quán)利要求3的方法，其中所述rpe細(xì)胞是自然分化、誘導(dǎo)分化或分離得到的人源或非人源的rpe細(xì)胞。

5.權(quán)利要求3的方法，其中所述rpe細(xì)胞是通過(guò)人胚干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化得到的。

6.權(quán)利要求3的方法，其中所述黑色素瘤細(xì)胞來(lái)源于患有黑色素瘤的患者。

7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞的懸液通過(guò)將所述細(xì)胞在乳酸鈉林格注射液或生理鹽水溶液中稀釋而制備，任選地在步驟(a)之前所述細(xì)胞的懸液經(jīng)過(guò)一次或多次稀釋。

8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中將等體積的懸液和ao/pi試劑混勻。

9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法測(cè)定所述懸液中的細(xì)胞活率和/或細(xì)胞密度。

10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞熒光分析儀為rigel?s2、s3或s5全自動(dòng)細(xì)胞熒光分析儀、countstar?mira?fl?plus或countstar?mira?fl?plus細(xì)胞熒光分析儀。

11.權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)的方法，其中在將所述rpe細(xì)胞用于藥物制備或臨床給藥之前進(jìn)行所述方法。

12.一種評(píng)估包含rpe細(xì)胞的藥物的質(zhì)量的方法，其中所述藥物包含待檢測(cè)其活率和/或細(xì)胞密度水平的rpe細(xì)胞，所述方法包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了檢測(cè)含黑色素細(xì)胞的活率和密度的方法以及所述方法在應(yīng)用RPE細(xì)胞治療的潛在用途。

技術(shù)研發(fā)人員：張愚,張帥,李丹丹,羅艷超,甘一迪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京澤輝辰星生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8