本發(fā)明涉及小麥育種，特別是涉及與小麥直鏈淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的分子標記kasp-sbeiia-d及其應用。
背景技術(shù)：
1、小麥(triticum?aestivum?l.)是全世界主要的糧食作物之一，全球約40％的人口以小麥為主糧。淀粉是成熟小麥籽粒的主要組成部分，約占籽粒胚乳的70％～80％。根據(jù)多糖鏈的形式，小麥淀粉分可為直鏈淀粉(amylose)和支鏈淀粉(amylopectin)，二者的比例約為1:3。這兩種主要淀粉的比例、精細結(jié)構(gòu)以及直鏈淀粉含量決定了淀粉的理化性質(zhì)以及產(chǎn)品的最終品質(zhì)。前人研究表明直鏈淀粉含量與抗性淀粉含量呈顯著性正相關(guān)，而抗性淀粉具有較好的生理功能，如預防糖尿病、抗消化以及利于腸道健康等。因此，可以通過提高小麥中直鏈淀粉含量來提高抗性淀粉的含量，從而開發(fā)具備保健功效的小麥保健型食品。此外，直鏈淀粉還具有持水力低、吸水性差、可膨化、糊化溫度高、熱量低等特點，適合用于食品直接加工或作為食品添加劑。直鏈淀粉還可以形成塑性較好的薄膜，作為重要的工業(yè)原料。但目前生產(chǎn)上推廣種植的小麥品種直鏈淀粉含量普遍偏低。因此，篩選和創(chuàng)制高直鏈淀粉含量的小麥種質(zhì)材料對功能性小麥新品種的培育具有重要意義。
2、小麥胚乳中淀粉的合成發(fā)生在淀粉體內(nèi)，合成過程復雜，需要多種酶共同參與，主要有adp-葡萄糖焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(ss)(包括顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(gbss)和可溶性淀粉合成酶(sss))、淀粉分支酶(sbe)、淀粉脫分支酶(dbe)、淀粉磷酸化酶(pho)和歧化酶(dpe)。淀粉分支酶(sbe)可以催化α-1,4糖苷鍵發(fā)生斷裂，并將切下的寡聚糖鏈通過α-1,6糖苷鍵連接，產(chǎn)生淀粉分支鏈。sbe可以影響谷物胚乳的精細結(jié)構(gòu)。除控制支鏈淀粉合成外，由于直鏈淀粉同樣具有少量的分支結(jié)構(gòu)，這就需要sbe在直鏈淀粉合成過程中同樣表現(xiàn)活躍。小麥中主要有兩類sbe：sbei和sbeii，其中sbeii具有兩個主要的同工酶，即sbeiia和sbeiib。sbeiia是小麥胚乳中可溶性相中的主要異構(gòu)體，在確定小麥籽粒中直連淀粉和支鏈淀粉的比例方面起主要作用。sestili等人使用rnai靶向sbeiia基因發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量大幅增加。
3、slade等人(2012)利用tilling技術(shù)在面包小麥tabeiia基因的a、b、d亞基因組上分別識別出一個stopgain突變位點。這三個stopgain突變位點分別位于a亞基因組5267bp處，g突變?yōu)閍；b亞基因組5039bp處，g突變?yōu)閍；d亞基因組5202bp處，g突變?yōu)閍。slade通過將含有這三個位點的小麥材料通過雜交使三個突變等位基因結(jié)合，獲得了純合突變系。slade認為相關(guān)位點的突變可導致rna剪接異常以及隨后改變或截短蛋白質(zhì)的翻譯。li等人(2019)研究發(fā)現(xiàn)錯義突變僅影響單個氨基酸，并且在改變淀粉結(jié)構(gòu)方面效果相對有限，同時研究發(fā)現(xiàn)tasbeiia純合stopgain突變的小麥系(rs140、rs100和rs2)的淀粉分子結(jié)構(gòu)變化更為顯著。李晶瑩等(2021)通過crispr-cas9基因編輯技術(shù)產(chǎn)生了tabeiia單突變體、二突變體以及三突變體材料，通過對成熟籽粒電鏡掃描發(fā)現(xiàn)隨著突變同源基因型數(shù)目的增加淀粉顆粒出現(xiàn)不同程度的變形，呈現(xiàn)劑量效應，其中三突變基因型淀粉顆粒形態(tài)變化最為明顯。
4、前人對于創(chuàng)制高直鏈淀粉含量小麥的遺傳策略進行了大量研究，但對于直鏈淀粉含量小麥分子標記的開發(fā)及應用研究相對較少。本發(fā)明擬開發(fā)與小麥直鏈淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的分子標記，從而有利于篩選出含有突變基因型且能穩(wěn)定遺傳的高直鏈淀粉小麥材料，縮短育種進程，以期為小麥高直鏈淀粉選育工作提供技術(shù)支持。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供與小麥直鏈淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的分子標記kasp-sbeiia-d及其應用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。該分子標記與小麥直鏈淀粉含量具有較高的相關(guān)性，可應用于高直鏈淀粉小麥的分子標記輔助選擇育種。
2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：
3、本發(fā)明提供一種與小麥直鏈淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的分子標記kasp-sbeiia-d，所述分子標記kasp-sbeiia-d的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，在所述核苷酸序列的第22位處堿基存在一個snp位點，為g/a突變。
4、本發(fā)明還提供一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的kasp引物組合，包括兩條正向引物和一條通用反向引物；所述兩條正向引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.2和seq?idno.3所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
5、本發(fā)明還提供上述的kasp引物組合在制備鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的產(chǎn)品中的應用。
6、進一步地，所述產(chǎn)品為試劑盒。
7、本發(fā)明還提供一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的產(chǎn)品，包括上述的kasp引物組合。
8、進一步地，所述產(chǎn)品為試劑盒。
9、本發(fā)明還提供上述的分子標記kasp-sbeiia-d、kasp引物組合或產(chǎn)品在鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀中的應用。
10、本發(fā)明還提供一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的方法，包括以下步驟：
11、提取得到待檢小麥的dna；
12、以所述dna為模板，利用上述的kasp引物組合進行熒光定量pcr擴增，得到待檢小麥的基因型，根據(jù)所述基因型判斷所述待檢小麥的直鏈淀粉含量：aa和ga基因型小麥的直鏈淀粉含量高于gg基因型小麥。
13、進一步地，所述熒光定量pcr擴增的反應體系為：higeno?2×probe?mix?b?3μl、kasp引物混合液0.0825μl、模板dna?3μl和ddh2o?4μl。
14、進一步地，所述熒光定量pcr擴增的反應程序為：94℃預變性10min；94℃變性30s，61℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低0.8℃；94℃變性30s，53℃退火延伸60s，循環(huán)34次。
15、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：
16、本發(fā)明以高直鏈淀粉小麥材料ham-2及ham-2×中麥255創(chuàng)建的f2代群體為材料，通過重測序在淀粉合成相關(guān)基因上篩選到大量的snp位點，發(fā)現(xiàn)在淀粉分支酶基因tasbeiia的d亞基因組上含有1個stopgain突變位點。針對篩選到的控制淀粉分支酶基因tasbeiia的stopgain突變位點，開發(fā)了一個分子標記——kasp-sbeiia-d，并在f2群體中進行驗證。通過基因分型，并結(jié)合f2群體直鏈淀粉含量測定結(jié)果，探究不同基因型對直連淀粉含量的影響。該分型結(jié)果說明了該分子標記的可靠性以及與小麥直鏈淀粉含量具有較高的相關(guān)性，因此可將該分子標記應用于高直鏈淀粉小麥的分子標記輔助選擇育種。
17、本發(fā)明提供的分子標記可以篩選出含有突變基因型且能穩(wěn)定遺傳的高直鏈淀粉小麥材料，從而縮短育種進程，為小麥高直鏈淀粉選育工作提供了技術(shù)支持。
1.一種與小麥直鏈淀粉含量顯著關(guān)聯(lián)的分子標記kasp-sbeiia-d，其特征在于，所述分子標記kasp-sbeiia-d的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，在所述核苷酸序列的第22位處堿基存在一個snp位點，為g/a突變。
2.一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的kasp引物組合，其特征在于，包括兩條正向引物和一條通用反向引物；所述兩條正向引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
3.一種如權(quán)利要求2所述的kasp引物組合在制備鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的產(chǎn)品中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品為試劑盒。
5.一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的產(chǎn)品，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述的kasp引物組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為試劑盒。
7.一種如權(quán)利要求1所述的分子標記kasp-sbeiia-d、權(quán)利要求2所述的kasp引物組合或權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品在鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀中的應用。
8.一種鑒別小麥直鏈淀粉含量性狀的方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光定量pcr擴增的反應體系為：higeno?2×probe?mix?b?3μl、kasp引物混合液0.0825μl、模板dna?3μl和ddh2o?4μl。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光定量pcr擴增的反應程序為：94℃預變性10min；94℃變性30s，61℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低0.8℃；94℃變性30s，53℃退火延伸60s，循環(huán)34次。