本發(fā)明涉及動物病毒學(xué)及分子生物學(xué)，尤其涉及一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大口黑鱸蛙虹彩病毒(largemouth?bass?ranavirus,lmbv)是一種大型雙鏈dna病毒，隸屬于虹彩病毒科(iridoviridae)蛙病毒屬(ranavirus)，是引發(fā)大口黑鱸(micropterus?salmoides)養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的主要病原體之一。由于lmbv感染常常不呈現(xiàn)特征性臨床癥狀，甚至沒有明顯的病癥表現(xiàn)，使得臨床診斷較為困難。然而，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，大口黑鱸感染lmbv后的發(fā)病率可達(dá)20％至30％，部分年份甚至超過40％，且在發(fā)病塘口內(nèi)的死亡率通常在20％至40％之間，極端情況下累積死亡率甚至超過80％。lmbv的流行水溫范圍在25℃至32℃之間，7月至8月為發(fā)病高峰期，且各種規(guī)格的大口黑鱸均可感染發(fā)病，急性發(fā)病的死亡期僅為3至5天，整個發(fā)病過程可持續(xù)約1個月。

2、lmbv的宿主范圍較廣，除大口黑鱸外，還能感染鱖(siniperca?chuatsi)和烏鱧(channa?argus)等其他魚類。尤其是在不同生長階段的小規(guī)格大口黑鱸中，lmbv表現(xiàn)出更高的致病性，且其毒力差異與毒株的基因型密切相關(guān)，然而，毒力相關(guān)的檢測方法未曾見報(bào)道。

3、因此，亟需一種高效檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列及其應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4、本發(fā)明還提供了所述的靶序列作為靶點(diǎn)在制備檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明還提供了一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的引物對，所述引物對包括上游引物和下游引物；

6、所述上游引物的序列如seq?id?no:2所示；

7、所述下游引物的序列如seq?id?no:3所示。

8、本發(fā)明還提供了所述的靶序列在制備減弱大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明還提供了一種制備減弱大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的方法，包括如下步驟：

10、對所述靶序列進(jìn)行敲除，獲得大口黑鱸蛙虹彩病毒減毒株；

11、所述敲除的長度為50bp～186bp，優(yōu)選為100～186bp，進(jìn)一步優(yōu)選為186bp。

12、本發(fā)明還提供了所述的引物對在制備檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的試劑盒中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供了一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的試劑盒，包括所述的引物對。

14、本發(fā)明還提供了一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的方法，包括如下步驟：

15、以大口黑鱸蛙虹彩病毒毒株的dna為模板，采用所述的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小判斷大口黑鱸蛙虹彩病毒的毒力。

16、作為優(yōu)選，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為0.5～1.5μl?dna提取液，0.5～1.5μl上游引物，0.5～1.5μl下游引物，20～30μl?2×taq?plus?mastermix，20～24μl水；

17、所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94～98℃預(yù)變性1～5min；94～98℃變性10～30s，45～55℃退火20～40s，70～74℃延伸20～40s，共30～37個循環(huán)；70～74℃延伸4～6min。

18、作為優(yōu)選，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有所述的靶序列，則大口黑鱸蛙虹彩病毒為強(qiáng)毒株；若擴(kuò)增產(chǎn)物中缺失所述的靶序列的50bp～186bp，則大口黑鱸蛙虹彩病毒為弱毒株。

19、本發(fā)明的有益效果：

20、本發(fā)明提供了一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列，并設(shè)計(jì)了一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的引物對，然后建立大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的快速區(qū)分；本發(fā)明的檢測方法可以高效、準(zhǔn)確地區(qū)分大口黑鱸蛙虹彩病毒是強(qiáng)毒株還是弱毒株，檢測時(shí)間能夠在1.5小時(shí)內(nèi)完成，為大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的精準(zhǔn)判別提供了強(qiáng)有力的支持，也為大口黑鱸蛙虹彩病毒強(qiáng)弱毒株篩選提供了有效手段。

技術(shù)特征：

1.一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.權(quán)利要求1所述的靶序列在制備減弱大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

3.一種制備減弱大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的方法，其特征在于，包括如下步驟：

4.權(quán)利要求1所述的靶序列作為靶點(diǎn)在制備檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5.一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的引物對，其特征在于，所述引物對包括上游引物和下游引物；

6.權(quán)利要求5所述的引物對在制備檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的試劑盒中的應(yīng)用。

7.一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求5所述的引物對。

8.一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為0.5～1.5μldna提取液，0.5～1.5μl上游引物，0.5～1.5μl下游引物，20～30μl2×taq?plusmastermix，20～24μl水；

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有權(quán)利要求1所述的靶序列，則大口黑鱸蛙虹彩病毒為強(qiáng)毒株；若擴(kuò)增產(chǎn)物中缺失權(quán)利要求1所述靶序列的50bp～186bp，則大口黑鱸蛙虹彩病毒為弱毒株。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及動物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；本發(fā)明還提供了一種檢測大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的引物對。本發(fā)明的檢測方法能夠高效、準(zhǔn)確的區(qū)分大口黑鱸蛙虹彩病毒的強(qiáng)弱毒株，檢測時(shí)間能夠在1.5小時(shí)內(nèi)完成，為大口黑鱸蛙虹彩病毒毒力的精準(zhǔn)判別提供了強(qiáng)有力的支持，也為大口黑鱸蛙虹彩病毒強(qiáng)弱毒株篩選提供了有效手段。

技術(shù)研發(fā)人員：潘曉藝,藺凌云,沈錦玉,高原,陳靜,姚嘉赟,黃雷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江省淡水水產(chǎn)研究所（浙江省淡水漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8