本發(fā)明屬于微生物菌群檢測(cè)，特別涉及乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在乳制品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)分析中，常常需要研究熱處理殺菌后或其他殺菌處理的樣品中殘留微生物種類，以評(píng)估質(zhì)量控制措施的有效性，并一進(jìn)步評(píng)估食品安全風(fēng)險(xiǎn)水平。

2、目前，對(duì)于微生物種類的分析鑒定方法，主要包括依賴傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)的鑒定技術(shù)(指需要分離到純菌株之后進(jìn)行鑒定的方法，如生化實(shí)驗(yàn)、maldi-tof質(zhì)譜、16s/its測(cè)序)和非培養(yǎng)技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)，雖然實(shí)驗(yàn)過程相對(duì)簡(jiǎn)單，但是分離、純化、鑒定等過程步驟繁多，且需要將所有分離到的菌進(jìn)行純化分析，工作量巨大。而高通量測(cè)序能夠同步測(cè)序更多的dna或rna樣本，非常方便又快速獲取大量基因序列數(shù)據(jù)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于大量微生物相關(guān)研究中。但是高通量測(cè)序分析檢測(cè)的對(duì)象是樣品中所有的dna，導(dǎo)致無法區(qū)分檢測(cè)的dna來自于衰亡的微生物還是存活的微生物，測(cè)序結(jié)果中包含殺菌處理后的大量死菌，導(dǎo)致樣品中的活菌和優(yōu)勢(shì)菌群無法準(zhǔn)確獲得。因此，當(dāng)前的高通量測(cè)序技術(shù)不能滿足乳制品樣品中活菌和優(yōu)勢(shì)菌的分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的高通量測(cè)序分析檢測(cè)無法分析出殺菌處理后乳制品樣品中殘留的活菌種類的技術(shù)缺陷，提供一種乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

3、步驟1、取待測(cè)牛奶樣品加入滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)18-24h后得到培養(yǎng)物，備用；所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的營(yíng)養(yǎng)成分包括蛋白胨、牛肉粉、葡萄糖；

4、步驟2、將所述培養(yǎng)物分別進(jìn)行高通量測(cè)序分析，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中相對(duì)豐度大于1％的菌種即為優(yōu)勢(shì)菌。

5、本發(fā)明的技術(shù)方案中，通過對(duì)待測(cè)牛奶樣品在高通量測(cè)序前進(jìn)行優(yōu)化處理，利用營(yíng)養(yǎng)肉湯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的性質(zhì)，活的微生物通過繁殖會(huì)在肉湯中有大量的dna信息，而衰亡菌不會(huì)繁殖，并通過轉(zhuǎn)接培養(yǎng)最終被稀釋的特點(diǎn)。將待分析的牛奶樣品接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，使得牛奶樣品中活的微生物得到大量繁殖，其中，營(yíng)養(yǎng)肉湯中含有的蛋白胨和牛肉粉可為微生物生長(zhǎng)提供碳氮源、維生素和生長(zhǎng)因子，絕大多數(shù)微生物可在其中繁殖。而牛奶中原本衰亡的微生物dna得到稀釋，將牛奶樣品培養(yǎng)后再配合進(jìn)行高通量測(cè)序分析，最終通過數(shù)據(jù)分析能夠得到牛奶樣本中活的微生物種類及優(yōu)勢(shì)菌信息。

6、將牛奶轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)可將牛奶中殘留的活菌增殖，但是上述營(yíng)養(yǎng)肉湯的成分不能滿足牛奶中所有種類的細(xì)菌都增殖良好。生乳中常見的菌屬通常包括芽孢桿菌、乳桿菌、腸桿菌等桿菌，以及腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌等球菌，還有一些假單胞菌。這些菌屬中，如嗜熱鏈球菌、枯草芽孢桿菌、乳桿菌等乳制品中常見菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)極其微弱。采取上述營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行牛奶樣品培養(yǎng)存在部分菌屬數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度低的技術(shù)缺陷，因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還包括甘露醇和丙酮酸鈉。

7、通過對(duì)待測(cè)牛奶樣品在高通量測(cè)序前進(jìn)行優(yōu)化處理，針對(duì)乳制品中活菌的類型，進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)肉湯配方的進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，蛋白胨、牛肉粉和葡萄糖可為微生物生長(zhǎng)提供碳氮源、維生素和生長(zhǎng)因子，甘露醇和丙酮酸鈉可補(bǔ)償某些細(xì)胞損傷，使牛奶中絕大多數(shù)微生物可在其中繁殖。

8、優(yōu)選的，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯包括以下重量份原料：蛋白胨10-15份、牛肉粉3-5份、氯化鈉4-6份、葡萄糖10-20份、甘露醇4-6份、丙酮酸鈉9-11份、水1000份。

9、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯包括以下重量份原料：蛋白胨10-12份、牛肉粉3-4份、氯化鈉4-5份、葡萄糖10-15份、甘露醇4-5份、丙酮酸鈉9-10份、水1000份。

10、優(yōu)選的，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯根據(jù)如下方式制備得到：根據(jù)重量份比例稱取相應(yīng)的成分，在水溶液中混合均勻形成混合液，將所述混合液120℃-125℃滅菌10-20分鐘，得到營(yíng)養(yǎng)肉湯。

11、優(yōu)選的，所述待測(cè)牛奶樣品與所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的體積比為1：(8-12)。

12、優(yōu)選的，所述待測(cè)牛奶樣品與所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的體積比為1：(9-10)。

13、優(yōu)選的，所述高通量測(cè)序分析的參數(shù)為：測(cè)序項(xiàng)目類型為16s/18s/its微生物分類測(cè)序，細(xì)菌擴(kuò)增類型為“細(xì)菌”、擴(kuò)增區(qū)域?yàn)椤凹?xì)菌v3-v4”；真菌擴(kuò)增類型為“真菌”、擴(kuò)增區(qū)域?yàn)椤罢婢鷌ts1-its2”。

14、所述步驟2中，高通量測(cè)序分析的樣品處理方式保持統(tǒng)一，取樣量一致。必要時(shí)可加入質(zhì)控菌株，以判斷高通量檢測(cè)過程的誤差。

15、第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N將所述的優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法在進(jìn)行牛奶中優(yōu)勢(shì)菌判斷中的應(yīng)用。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

17、本發(fā)明的技術(shù)方案中，通過對(duì)待測(cè)牛奶樣品在高通量測(cè)序前進(jìn)行優(yōu)化處理，利用營(yíng)養(yǎng)肉湯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的性質(zhì)，活的微生物通過繁殖會(huì)在肉湯中有大量的dna信息，而衰亡菌不會(huì)繁殖，并通過轉(zhuǎn)接培養(yǎng)最終被稀釋的特點(diǎn)。將待分析的牛奶樣品接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，使得牛奶樣品中活的微生物得到大量繁殖，其中，營(yíng)養(yǎng)肉湯中含有的蛋白胨和牛肉粉可為微生物生長(zhǎng)提供碳氮源、維生素和生長(zhǎng)因子，絕大多數(shù)微生物可在其中繁殖。而牛奶中原本衰亡的微生物dna得到稀釋，將牛奶樣品培養(yǎng)后再配合進(jìn)行高通量測(cè)序分析，最終通過數(shù)據(jù)分析能夠得到牛奶樣本中活的微生物種類及優(yōu)勢(shì)菌信息。

技術(shù)特征：

1.乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還包括甘露醇和丙酮酸鈉。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯包括以下重量份原料：蛋白胨10-15份、牛肉粉3-5份、氯化鈉4-6份、葡萄糖10-20份、甘露醇4-6份、丙酮酸鈉9-11份、水1000份。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯包括以下重量份原料：蛋白胨10-12份、牛肉粉3-4份、氯化鈉4-5份、葡萄糖10-15份、甘露醇4-5份、丙酮酸鈉9-10份、水1000份。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)肉湯根據(jù)如下方式制備得到：根據(jù)重量份比例稱取相應(yīng)的成分，在水溶液中混合均勻形成混合液，將所述混合液120℃-125℃滅菌10-20分鐘，得到營(yíng)養(yǎng)肉湯。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)牛奶樣品與所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的體積比為1：8-12。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)牛奶樣品與所述營(yíng)養(yǎng)肉湯的體積比為1：9-10。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述高通量測(cè)序分析的參數(shù)為：測(cè)序項(xiàng)目類型為16s/18s/its微生物分類測(cè)序，細(xì)菌擴(kuò)增類型為“細(xì)菌”、擴(kuò)增區(qū)域?yàn)椤凹?xì)菌v3-v4”；真菌擴(kuò)增類型為“真菌”、擴(kuò)增區(qū)域?yàn)椤罢婢鷌ts1-its2”。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中，高通量測(cè)序分析的樣品處理方式保持統(tǒng)一，取樣量一致。

10.將權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法在進(jìn)行牛奶中優(yōu)勢(shì)菌判斷中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于微生物菌群檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及乳制品中活菌種類以及優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用。通過對(duì)待測(cè)牛奶樣品在高通量測(cè)序前進(jìn)行優(yōu)化處理，先將牛奶在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)肉湯中含有的蛋白胨和牛肉粉可為微生物生長(zhǎng)提供碳氮源、維生素和生長(zhǎng)因子，絕大多數(shù)微生物可在其中繁殖。利用營(yíng)養(yǎng)肉湯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的性質(zhì)，活的微生物通過繁殖會(huì)在肉湯中有大量的DNA信息，而衰亡菌不會(huì)繁殖，并通過轉(zhuǎn)接培養(yǎng)最終被稀釋的特點(diǎn)，將待分析的牛奶樣品接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，使得牛奶樣品中活的微生物得到大量繁殖，而牛奶中原本衰亡的微生物DNA得到稀釋，最后結(jié)合高通量測(cè)序分析手段，得到牛奶樣本中活的微生物種類的信息。

技術(shù)研發(fā)人員：夏忠悅,駱敏,馬靜,劉麗平,宋艷梅,范光彩,周歡,譚蓮英,黃宇,付林,陳東海
受保護(hù)的技術(shù)使用者：新希望乳業(yè)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8