新的細(xì)胞特異性活性核苷酸分子及其應(yīng)用試劑盒的制作方法
【專利說明】新的細(xì)胞特異性活性核苷酸分子及其應(yīng)用試劑盒
[0001]本發(fā)明涉及新的基于核苷酸的生物活性分子，通過其可以通過靶向方式在特定細(xì)胞中誘導(dǎo)或降低基因表達(dá)，本發(fā)明還涉及應(yīng)用試劑盒。
[0002]通過將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，可以實(shí)現(xiàn)基因或基因區(qū)段、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的產(chǎn)生，其在插入的DNA序列上編碼，以及較短或較長的肽的產(chǎn)生；或者，在插入干擾RNA分子的情況中，可以抑制與該RNA互補(bǔ)的特定基因區(qū)段的表達(dá)?；虮磉_(dá)的抑制可以例如通過插入siRNA(短干擾RNA) SmiRNA(microRNA)而實(shí)現(xiàn)。典型地，在激活時(shí)，siRNA分子可以與靶基因的mRNA相互作用，及與特異性內(nèi)切核糖核酸酶組合形成稱作“RISC”的RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)。RISC復(fù)合物結(jié)合靶mRNA，其中內(nèi)切核酸酶切割靶mRNA。以此方式，基因表達(dá)被阻止，及因此靶蛋白質(zhì)的形成被抑制。
[0003]已經(jīng)描述了通過在真核細(xì)胞中導(dǎo)入特異于靶基因mRNA的序列區(qū)段的短的(19_23bp)雙鏈 RNA 分子(siRNA)抑制基因表達(dá)(Elbashir SM et al.:Duplexesof 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammaliancelIs,Nature,2001,May 24，411 (6836)，494-8 ;Liu Y et al.!Efficient andisoform-selective inhibit1n of cellular gene express1n by peptide nucleicacids, B1chemistry, 2004Feb 24，43(7)，1921-7 ；US 5，898，031A ;US 7，056，704B2)。
[0004]這種分子的使用不阻止基因的轉(zhuǎn)錄及mRNA的產(chǎn)生，但是siRNA啟動降解靶mRNA的細(xì)胞機(jī)制。最終，如上所述，特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生被抑制，而不干擾其它基因的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。
[0005]目前，siRNA的應(yīng)用通常針對特定抑制細(xì)胞中一個(gè)單一基因的表達(dá)。因此，同時(shí)或以非特異性方式沉默幾個(gè)基因的作用不是需要的，因此以這些作用被抑制的方式設(shè)計(jì)mRNA的序列。
[0006]本領(lǐng)域也揭示了針對在體內(nèi)用siRNA增加靶組織的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法(Ikedaet al.: “Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA，，，PharmaceuticalResearch, Vol.23，N0.8，August 2006)或者通過結(jié)合以細(xì)胞特異性方式裂解的短肽實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性的方法(W0 2008/098569 A2)。通過使用所述修飾的siRNA分子，可以選擇性降低或抑制特定細(xì)胞中基因的表達(dá)。
[0007]然而，核酸靶向作用的這些方法通常限于短核酸序列；較長的序列存在分子不穩(wěn)定的問題，因此不能通過靶向輸送有效地插入細(xì)胞中；已知的在較長核酸末端的短肽結(jié)合及其細(xì)胞特異性裂解通常不導(dǎo)致希望的細(xì)胞特異性作用，因?yàn)殚LRNA或DNA序列末端的肽結(jié)合不導(dǎo)致足夠的失活。
[0008]本發(fā)明的潛在問題是修飾長核酸分子，由此其生物學(xué)功能通過化學(xué)修飾被可靠地失活以及也可以細(xì)胞特異性地完全再激活。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，一些肽或聚合物結(jié)合核酸分子，由此其空間結(jié)構(gòu)被徹底修飾，以便其生物學(xué)功能不再有保證或者通常與核酸退火的分子可不再接近該核酸。
[0010]本發(fā)明的問題通過將長度超過21個(gè)堿基的單鏈或雙鏈核苷酸分子插入細(xì)胞中而解決，特征在于為了失活，將核苷酸分子與至少一個(gè)肽或聚合物結(jié)合，所述肽或聚合物抑制分子的生物學(xué)活性及可以由酶裂解，及因此所述生物學(xué)活性可再激活。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了抑制核苷酸分子，至少一個(gè)肽或聚合物可以結(jié)合在核苷酸末端之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了抑制核苷酸分子，至少一個(gè)肽或聚合物可以與核苷酸主鏈結(jié)合，由此兩個(gè)末端彼此結(jié)合。在再一個(gè)實(shí)施方案中，提供了這樣的構(gòu)建體，其中為了抑制核苷酸分子，至少一個(gè)肽結(jié)合在核苷酸的末端之間，及此外至少一個(gè)肽或聚合物與核苷酸的主鏈結(jié)合，由此兩個(gè)末端彼此結(jié)合。
[0011]在上文的含義內(nèi)，本發(fā)明本質(zhì)上特別基于長核酸分子，其被設(shè)計(jì)為其生物學(xué)功能通過化學(xué)修飾被可靠地失活，及也可以細(xì)胞特異性地完全再激活。在本發(fā)明中，術(shù)語“長核苷酸分子”或者“長核酸分子”不僅包含長度超過21個(gè)堿基的分子。特別地，也包含長度超過23個(gè)堿基的核苷酸分子或核酸分子。優(yōu)選長度超過25個(gè)堿基的核苷酸分子或核酸分子。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述長核酸分子通過化學(xué)修飾被修飾，由此其生物學(xué)功能被可靠地失活及也可以細(xì)胞特異性地被完全再激活，其中所述核酸分子或核苷酸分子的長度超過30、40、50或更多個(gè)堿基。
[0012]然而，根據(jù)本發(fā)明還提供了單鏈或雙鏈核苷酸分子以插入細(xì)胞中，特征在于為了將其失活，將核苷酸分子與至少一個(gè)肽或聚合物結(jié)合，所述肽或聚合物抑制該分子的生物學(xué)活性且可以被酶裂解，因此所述生物學(xué)活性被再激活，本發(fā)明特別提供了長度在23-10000個(gè)堿基范圍的分子。
[0013]本發(fā)明的核苷酸分子或核酸分子特別優(yōu)選具有長度范圍為23、25、30、40或50至100個(gè)堿基，特別是范圍為23至100個(gè)堿基。典型地，這些長度見于來自shRNA、miRNA和反義核苷酸一組中的核苷酸分子或核酸分子，然而并不限于這些。
[0014]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，還提供了單鏈或雙鏈核苷酸分子以插入細(xì)胞中，特征在于為了失活，將核苷酸分子與至少一個(gè)肽或聚合物結(jié)合，所述肽或聚合物抑制該分子的生物學(xué)活性且可以被酶裂解，由此所述生物學(xué)活性被再激活，本發(fā)明特別提供了長度優(yōu)選在100-2000個(gè)堿基范圍的分子。典型地，這些長度見于來自合成mRNA、Spiegelmers和適體一組中的核苷酸分子或核酸分子，然而不限于此。
[0015]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，還提供了單鏈或雙鏈核苷酸分子以插入細(xì)胞中，特征在于為了失活，將核苷酸分子與至少一個(gè)肽或聚合物結(jié)合，所述肽或聚合物抑制分子的生物學(xué)活性及可以被酶裂解，因此所述生物學(xué)活性被再激活，特別提供了優(yōu)選長度在2000-10000個(gè)堿基范圍的分子。典型地，這些長度見于核苷酸分子或核酸分子如mRNA，然而不限于此。
[0016]與描述的方法相反，其中短核苷酸分子通過結(jié)合本發(fā)明的肽或聚合物而由于肽的結(jié)構(gòu)而被生物學(xué)失活，提示以這種方式設(shè)計(jì)肽或聚合物，由此核苷酸的結(jié)構(gòu)被修飾，及因此其生物學(xué)活性被抑制。如果肽或聚合物通過特異性酶從核苷酸中裂解，其恢復(fù)至其原始結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生其正常生物學(xué)活性。
[0017]通過特異性酶的裂解可以用細(xì)胞的特異性疾病或發(fā)育條件(特別是干細(xì)胞中細(xì)胞周期或分化)被特定誘導(dǎo)，所述酶呈現(xiàn)出特異于特定細(xì)胞類型或其疾病相關(guān)修飾的活性(特別是變性或感染)或者基因型特異性活性。此外，可以發(fā)生特異性裂解以檢測特異性酶或者所提及的應(yīng)用。
[0018]在本發(fā)明中，特異性酶可以是蛋白酶或肽酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶、氨基肽酶或絲氨酸蛋白酶，特別是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶_4、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-5、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶_7、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、KLK4、PLAP、IRAP、uPA、FAP-α或者病毒蛋白酶，例如HIV蛋白酶、柯薩奇病毒蛋白酶、Epstein-Barr病毒蛋白酶、甲型肝炎病毒蛋白酶、乙型肝炎病毒蛋白酶、丙型肝炎病毒蛋白酶)，核酸酶，糖苷酶，蔗糖酶或者殼多糖酶。
[0019]由于肽或聚合物與例如micro (mi) RNA的所述結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)的修飾，這通常是通過序列同源性發(fā)生的。當(dāng)肽或聚合物與mRNA結(jié)合時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)與mRNA退火的起始位點(diǎn)被覆蓋以翻譯，及因此在mRNA上編碼的蛋白質(zhì)不被表達(dá)。
[0020]肽或聚合物鍵的選擇不限于核苷酸分子的末端，但是結(jié)合也可以發(fā)生在核苷酸的糖分子、在磷酸鹽或有機(jī)堿基。
[0021]如上文所述，本發(fā)明的單鏈或雙鏈核苷酸分子的性質(zhì)不限于特定核酸分子種類或核苷酸分子種類。因此，本發(fā)明的單鏈或雙鏈核苷酸分子可以是mRNA、shRNA或PNA。然而，本發(fā)明的單鏈或雙鏈核苷酸分子也可以是適體或Spiegelmer。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈或雙鏈分子可以是免疫刺激RNA。此外，單鏈或雙鏈核苷酸分子不僅僅是以上述各個(gè)核苷酸分子種類之一的形式提供。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的單鏈或