一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫和禽流感是當(dāng)今全球范圍內(nèi)最流行的家禽傳染病，也是我國所有雞病中危 害最大的兩種疾病。二聯(lián)疫苗的制備，可W-針防治兩種傳染病，同時(shí)可W解決使用多種疫 苗分次免疫，造成的雞群的其它的不良反應(yīng)，簡化免疫程序，降低投入的成本。當(dāng)前國內(nèi)生 產(chǎn)的新城疫、禽流感二聯(lián)滅活疫苗基本都是采用雞胚接種病毒后進(jìn)行增殖，收獲尿囊液制 備而成。傳統(tǒng)的二聯(lián)疫苗均由單一疫苗分別生產(chǎn)后混合在一起制成二聯(lián)疫苗，該工藝費(fèi)時(shí) 費(fèi)力，生產(chǎn)成本較高。同胚培養(yǎng)是近年來獸用生物制品行業(yè)提出的生產(chǎn)工藝，即將兩種病毒 W合適的比例混合后同時(shí)接種到雞胚中進(jìn)行增殖，該工藝減少了生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)，縮短的生 產(chǎn)周期，減少人力物力投入，大大降低了生產(chǎn)成本。但是截至到目前為止同胚培養(yǎng)的工藝仍 存在缺陷，特別是雞新城疫、禽流感的同胚培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中由于病毒之間的互相干擾，兩 種病毒的含量均不穩(wěn)定，批次間差異較大，困擾著該品種的生產(chǎn)，嚴(yán)重影響了后期疫苗的品 質(zhì)。
[0003] 氨基酸，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì) 的基本物質(zhì)。維生素是維持機(jī)體生命活動必須的一類有機(jī)物質(zhì)，也是保持機(jī)體健康的重要 活性物質(zhì)。維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子，維生素是維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常代謝 的重要物質(zhì)。在體內(nèi)砸和維生素E協(xié)同，能夠保護(hù)細(xì)胞膜，防止不飽和脂肪酸的氧化。
[0004] 多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作 為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的 各種活動。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。但是中藥多糖的作用并不具有廣譜性，同常某種或某幾種 多糖協(xié)同作用具有特異性的活性作用。
[0005] 本發(fā)明基于上述技術(shù)背景，提出一種同胚培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用，具體是一種特別 適用于雞新城疫、禽流感病毒同胚培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用，解決了新城疫病毒、禽流感病毒 同胚培養(yǎng)穩(wěn)定性差、批次間差異大的培養(yǎng)難題，提高了兩種病毒的穩(wěn)定性、收獲量和病毒滴 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種雞新城疫、禽流感病 毒同胚培養(yǎng)的方法的技術(shù)方案，通過該方法，可同時(shí)提高兩種病毒的穩(wěn)定性、收獲量和病毒 滴度。
[0007] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于采用雞新城疫、禽流感 特異性病毒稀釋液稀釋新城疫病毒至1000-5000倍，稀釋禽流感病毒至5000-10000倍，分 別在4°C解育30-60分鐘后按1:1比例混合均勻，接種9-10日齡雞胚，0. 1-0. 15ml/胚， 36-37°C繼續(xù)培養(yǎng)至96小時(shí)，棄去48小時(shí)前死亡雞胚，收獲48-96小時(shí)死活胚液，既得雞新 城疫病毒、禽流感病毒混合病毒液。
[0008] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的雞新城疫、禽流 感特異性病毒稀釋液為每1000ml憐酸緩沖液中含有W下重量配比的組分：氨基酸組合2~ 4g、維生素組合3~6g、亞砸酸鋼0~lOmg和復(fù)方中藥多糖20~50g; 所述的氨基酸組合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酷胺； 所述的維生素組合包括維生素B1、維生素B3和維生素B7 ; 所述的復(fù)方中藥多糖由海藻、地膚子、桑葉、牽牛子和丹參提取得到。
[0009] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于該稀釋液的抑為 7. 0 ~7. 2。
[0010] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的憐酸緩沖液由 氯化鋼6~lOg，氯化鐘0. 05~0. 5g，憐酸氨二鋼1~1. 2g，憐酸二氨鐘0. 05~0. 5g，氯 化巧0. 05~0. 2g，含6個結(jié)晶水的氯化儀0. 05~0. 2g溶于1000ml雙蒸水中得到。
[0011] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的氨基酸組合中 含有：天冬氨酸20~50%、脯氨酸20~40%和谷氨酷胺10~60%，優(yōu)選為天冬氨酸30~ 40%、脯氨酸25~35%和谷氨酷胺30~40%。
[0012] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的維生素組合中 含有：維生素B1 15~35%、維生素B3 20~50%和維生素B7 20~50%，優(yōu)選為維生素B1 20~30%、維生素B3 30~40%和維生素B7 35~45〇/〇。
[0013] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖 按W下步驟制得： a、 按海藻20~40份、地膚子5~20份、桑葉10~30份、牽牛子5~20份和丹參10~ 30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉。
[0014] 所述的一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的雞新城疫、禽流 感特異性病毒稀釋液通過W下步驟制得： 1) 憐酸緩沖溶液的配制：按比例稱取氯化鋼、氯化鐘、憐酸氨二鋼、憐酸二氨鐘、氯化 巧、含6個結(jié)晶水的氯化儀溶于雙蒸水中，無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌備用； 2) 復(fù)方中藥多糖的制備 a、按比例稱取海藻、地膚子、桑葉、牽牛子和丹參，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加 入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分 鐘攬拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉； 3)接種雞胚用病毒稀釋液配制：按比例稱取氨基酸組合、維生素組合、復(fù)方中藥多糖和 亞砸酸鋼，溶解于步驟1)制得的憐酸緩沖溶液中，充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)抑至6. 6~7. 0 之間，無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0015] 本發(fā)明具有積極有益的效果： (1)本發(fā)明所制備的稀釋液，可接種低日齡雞胚，因低日齡雞胚組織分化程度較低，與 現(xiàn)有技術(shù)相比，病毒更易在雞胚組織中增殖。
[0016] (2)本發(fā)明所制備的稀釋液接種雞胚后，可提高雞胚耐受病毒的能力，延長死亡時(shí) 間，即延長了病毒增殖時(shí)間，與現(xiàn)有技術(shù)相比提高了病毒滴度2~8倍。
[0017] (3)按本發(fā)明方法培養(yǎng)收獲的病毒液提高了同胚培養(yǎng)的穩(wěn)定性，大大降低了批次 間差異，為后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝提供了優(yōu)質(zhì)的抗原液。