Senp3基因及其表達產物作為食管癌的診治靶標的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了SENP3基因及其表達產物可以作為食管癌診治的分子標志物。通過檢測組織中SENP3基因及其表達產物的含量可以判斷受試者是否患有食管癌或者診斷受試者是否存在患有食管癌的風險。本發(fā)明通過研究體外培養(yǎng)的食管癌細胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)SENP3基因的表達抑制可以抑制食管癌細胞增殖，并且通過抑制SENP3蛋白的功能同樣可以抑制食管癌細胞的增殖，上述研究結果表明SENP3基因及其表達產物是治療食管癌的一個潛在的藥物靶點。
【專利說明】
SENP3基因及其表達產物作為食管癌的診治革田標
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，具體地設及SENP3基因在食管癌的診斷、治療中的用 途。
【背景技術】
[0002] 食管癌化C)是目前世界上最為常見的十種惡性腫瘤之一(每年有超過300,000新 發(fā)病例），食管癌的預后較差，五年生存率不到10%。在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率第二，僅次于 胃癌，占所有惡性腫瘤的2%，且發(fā)病率和死亡率居高不下，在各種惡性腫瘤引起的死亡患 者中占第六。在所有食管癌患者中，中老年人群所占比重較高，且具有易發(fā)性，總體來說，年 齡低于30歲，發(fā)病率低，30歲W后發(fā)病率與年齡的增長成正相關。中國是食管癌高發(fā)區(qū)，每 年新增250000名患者，但160000的食管癌患者死亡?，F(xiàn)有的治療食管癌的方式主要有手術 切除、放射治療、化學藥物治療等，W上治療措施的應用不能有效提高患者的生存率和生活 質量。因此對食管癌進行研究，探明其可能發(fā)生機制及尋找診斷和治療新途徑等乃當務之 急。目前廣大的醫(yī)學工作者致力于在基因水平進行干預，為食管癌的治療帶來了新希望。有 文獻報道食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的結果。目前在食管癌組織中已發(fā)現(xiàn)多種表 達異常的基因和蛋白，如DCR3基因、？〔魁、68?1、51413、〔￥化^01、￥66及食管癌相關基因4 等，目前運方面研究較多，但運些基因在臨床上的價值微乎其微，不能對食管癌患者治療效 果和預后做出有效的判斷提，因此新的的基因或標志物急需研究證實和尋找，例如在肝癌 患者中外周血查AFP就具有較高的敏感性。當患者自訴有進行性吞咽困難癥狀時，一般已經 是食管癌中晚期。因此早期診斷食管癌是目前提高患者生存率和治愈率的有效方法，特別 是與食管癌相關的腫瘤標記物被認為是早期診斷的有效方法之一

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于食管癌早期診斷的分子標志物。相比現(xiàn)有的食 管癌的診斷方法，使用基因標志物來診斷食管癌的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患 者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取相應的預防和治療措施。
[0004] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測SENP3基因表達的產品在制備診斷食管癌的工具中的應用。
[0006] 進一步，所述檢測SENP3基因表達的產品包括檢測SENP3基因 mRNA水平的產品、和/ 或檢測SENP3蛋白水平的產品。
[0007] 進一步，所述檢測SENP3基因表達的產品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 、原位雜交或忍片檢測SENP3基因表達W診斷食管癌的產品。
[000引進一步，所述用RT-PCR診斷食管癌的產品至少包括一對特異擴增SENP3基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷食管癌的產品至少包括一對特異擴增SENP3基因的引物;所述 用免疫檢測診斷食管癌的產品包括:與SENP3蛋白特異性結合的抗體;所述用原位雜交診斷 食管癌的產品包括:與SENP3基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管癌的產品包 括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與SENP3蛋白特異性結合的抗體，基因忍片包 括與SENP3基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 所述用實時定量PCR診斷食管癌的產品至少包括的一對特異擴增SENP3基因的引 物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述檢測SENP3基因表達的產品可W是檢測SENP3基因表達的試劑、也可W是包含 所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測序平臺。
[0011] 所述診斷食管癌的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高 通量測序平臺是一種特殊的診斷食管癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的 基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜， 容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知SENP3基因的異常與食 管癌相關也屬于SENP3基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷食管癌的工具，所述工具包括檢測SENP3基因表達的試 劑;所述試劑包括檢測SENP3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測SENP3蛋白的抗體。
[0013] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測SENP3基因轉錄水平的針對 SENP3基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質忍片包括固相載體W及固定在固相載體的SENP3蛋 白的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測包括SENP3基因在內的多個基因（例如，與食管 癌相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白質忍片可用于檢測包括SENP3蛋白在內的多個蛋 白質(例如與食管癌相關的多個蛋白質）的表達水平。通過將多個與食管癌的標志物同時檢 ，可大大提高食管癌診斷的準確率。
[001引其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測SENP3基因轉錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括SENP3蛋白的 特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片 方法檢測SENP3基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對SENP3基因的 引物和/或探針。根據SENP3基因的核巧酸序列信息容易設計出可W用于檢測SENP3基因表 達水平的引物和探針。
[0016] 所述試紙包括檢測SENP3基因表達的試劑。
[0017] 所述高通量測序平臺包括檢測SENP3基因表達的試劑。
[0018] 與SENP3基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結合， 任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的 長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜 交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超 過30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序 列最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0019] 進一步，所述SENP3蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述SENP3蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 化6、尸(曰6'）2、尸乂等。只要所述片段能夠保留與56肥3蛋白的結合能力即可。用于蛋白質水平 的抗體的制備時本領域技術人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述檢測SENP3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4所示的引物對。
[0021] 本發(fā)明還提供了 SENP3基因和/或其表達產物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物 中的應用。所述抑制劑包括抑制SENP3基因表達的試劑、和/或抑制SENP3基因表達產物的試 劑。
[0022] 進一步，所述抑制SENP3基因表達的試劑包括抑制基因轉錄的試劑、抑制基因翻譯 的試劑;所述抑制SENP3基因表達產物的試劑包括抑制SENP3基因 mRNA的試劑、抑制SENP3蛋 白的試劑。所述抑制SENP3基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性 的試劑。所述抑制SENP3蛋白的試劑包括抑制SENP3蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制SENP3蛋白活性 的試劑、抑制SENP3蛋白功能的試劑。
[0023] 進一步，抑制SENP3基因 mRNA的試劑包括針對SENP3基因 mRNA的雙鏈核糖核酸;抑 審傾NP3蛋白功能的試劑包括SENP3抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制SENP3蛋白功能的抗體。所述 抗體可W是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0024] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對SENP3基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。 為了確保SENP3基因能夠被高效剔除或沉默，根據SENP3基因的mRNA序列設計了 SiRNA特異 性片段。SiRNA的設計根據已發(fā)表的通用設計原則化化ashir et.al 2001 ,Schwarz et.al 2003,趾vorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of肺itehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research AwarcUhttps ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。為了 進一步提高SiRNA片斷的有效性，綜合兩個在線設計工具的優(yōu)點來設計用于篩選的SiRNA片 斷。最后，通過同源性比對(NCBI BLAST)來過濾S iRNA序列，W提高S iRNA片斷的特異性并減 少RNAi干擾的脫祀效應。
[0025] 優(yōu)選地，所述SiRNA的序列如沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療食管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的SENP3基因和/或其表達產物的抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋 劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠 凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者W上的混合。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療食管癌的藥劑。
[0029] 本發(fā)明的藥物組合物首選應用于哺乳動物，其中該哺乳動物優(yōu)選為人類病患。
[0030] 本發(fā)明的藥物組合物可例如W 口服、注射等方式給予至該人類病患體內。
[0031] 本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療食管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可W 大大提到治療的成功率。
[0032] 在本發(fā)明的上下文中/'SENP3基因"包括SENP3基因 W及SENP3基因的任何功能等 同物的多核巧酸。SENP3基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據庫GeneBank中SENP3基因 (NC_000017.11)DNA序列具有70%W上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0033] 優(yōu)選地，沈NP3基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0034] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0035] (2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0036] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70 %、優(yōu)選地，90 % W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質的DNA分子。
[0037] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述SENP3基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[003引在本發(fā)明的上下文中，SENP3基因表達產物包括SENP3蛋白W及SENP3蛋白的部分 膚。所述SENP3蛋白的部分膚含有與食管癌相關的功能域。
[0039] "SENP3蛋白"包括SENP3蛋白W及SENP3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括SENP3蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變 體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與SENP3的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質。
[0040] 優(yōu)選地，SENP3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質：
[0041] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0042] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0043] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構成的多膚。
[0044] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述SENP3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序 列的蛋白質。
[0045] 通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。 本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。
[0046] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質的例子是SENP3蛋白的融合 蛋白。對于與SENP3蛋白融合的膚或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留SENP3蛋 白的生物學活性即可。
[0047] 本發(fā)明的SENP3蛋白也包括對SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經過修飾的蛋白質仍然能夠保留SENP3蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[004引在本發(fā)明的上下文中，"診斷食管癌"既包括判斷受試者是否已經患有食管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有食管癌的風險。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管癌"從疾病的狀態(tài)變化來分，可W包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括用于評價疾病的治療效果。
[0050] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0051] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 SENP3基因表達與食管癌相關，通過檢測受試者組織中SENP3的 表達，可W判斷受試者是否患有食管癌、或者判斷受試者是否存在患有食管癌的風險，從而 指導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治療方案。
[0052] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記物-SENP3基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷 更及時、更特異、更靈敏，能夠實現(xiàn)食管癌的早期診斷，從而降低食管癌的死亡率。
【附圖說明】
[0053] 圖1顯示利用基因忍片檢測SENP3基因在食管癌組織與正常組織中的表達情況； [0化4]圖2顯示利用Western blot檢測SENP3蛋白在食管癌組織與正常組織中的表達情 況；
[0化5] 圖3顯示利用QPCR檢測SiRNA對沈NP3基因的干擾效率；
[0化6] 圖4顯示利用Western blot檢測SiRNA對沈NP3蛋白表達的影響；
[0057]圖5顯示抑制SENP3蛋白功能對食管癌細胞增殖的影響。
[005引具體的實施方式
[0059] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0060] 實施例1 SENP3基因的差異表達
[0061] 1、實驗材料；
[0062] 食管癌組織為醫(yī)院胸外科手術切除的標本，正常組織為胃鏡室鏡下取出的標本， 手術切除的食管腫瘤組織離體后立即取材，取材時均佩戴一次性無菌手套，應用高壓滅菌 的手術刀片切取。
[0063] 所有病例均經病理確診。包括食管癌組織40例，正常食管組織30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。W正常食管組織作為對照組。所有患者術前均病理證實，術前均未行放 療、化療等治療，且無其他部位的腫瘤等。所有組織均在手術半小時內液氮保存后，移入-80 度冰箱凍存。
[0064] 2、食管癌組織和正常食管上皮組織的RNA的獲取
[00化]使用化i Z01-步法提取食管癌組織和正常食管組織的總RNA，通過化no化op ND-1000讀取260nm和28化m處的吸光度值(A)測定RNA溶液的純度。經1 %甲醒變性瓊脂糖凝膠 電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。
[0066] 3、基因忍片雜交及掃描
[0067] 總RNA經線性化擴增后，cy3-UTP標記，巧光標記后的cRNAs采用歴EASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA化agmen化tion Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達譜忍片(4x 44K基因），在忍片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0068] 4、忍片數(shù)據處理與分析
[0069] 雜交后的忍片經忍片掃描儀讀取數(shù)據點后，將數(shù)據導入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。
[0070] 5、統(tǒng)計學處理
[0071]采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P< 0.05差異有顯著性意義。
[007^ 6、結果
[0073] 結果顯示（如圖1所示），與正常食管組織相比，食管癌組織中SENP3基因的mRNA水 平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇.05)。
[0074] 實施例2 SENP3蛋白的差異表達 [00巧]1、研究對象同實施例1。
[0076] 2、提取組織總蛋白
[0077] 按照化i如化組織/細胞總蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Weste;rn blot檢測
[0079] 將提取的蛋白定量進行SDS-PAGE電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗解育、二抗解育、 顯色。
[0080] 4、統(tǒng)計學處理
[0081 ]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進行分析，We-actin為內參，將SENP3蛋白 條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數(shù)據都是W平均值±標準差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
[00劇 5、結果
[0083] 結果如圖2所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中SENP3蛋白的表達水平顯著 增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇. 05)。
[0084] 實施例3抑制SENP3基因表達
[0085] UsiRNA設計合成
[0086] 針對 SENP3 的 SiRNA 序列：
[0087] SiRNAl-沈NP3:
[008引 正義鏈為5'-ACGUUUGAAGGAAUUCGUCCA-3'（沈Q ID N0.7);
[0089] 反義鏈為5'-GACGAAUUCCUUCAAACGUAU-3'（沈Q ID N0.8)，
[0090] siRNA2-沈 NP3:
[0091] 正義鏈為5'-AACUAUUGAAGAAAUGCACCU-3'（沈Q ID N0.9);
[0092] 反義鏈為5'-GUGCAUUUCUUCAAUAGUUUC-3'（SEQ ID N0.10)，
[0093] siRNA3-沈NP3:
[0094] 正義鏈為5'-UAGAUACUUGGCAAUAUGCUU-3'（沈Q ID N0.11);
[0095] 反義鏈為5'-GCAUAUUGCCAAGUAUCUACA-3'（沈Q ID N0.12)
[0096] 陰性對照SiRNA序列(SiRNA-NC):
[0097] 正義鏈為5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（沈Q ID N0.13);
[009引反義鏈為5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（沈Q ID N0.14)。
[0099] 2、食管癌細胞的培養(yǎng)與轉染
[0100] 2.1細胞培養(yǎng)
[0101] 食管癌細胞系ECA109接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、將其放置于37 °C、5 % CO播養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞達80 %融合時，用0.化％膜蛋白酶消化傳代。
[0102] 2.2細胞轉染
[0103] 將食管癌細胞按1 X 10^孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細 胞培養(yǎng)24h，轉染按照脂質體轉染試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉染，實驗分 為、陰性對照組和實驗組(20nM)，其中，陰性對照組SiRNA與SENP3基因的序列無同源性，濃 度為20nM/孔，同時分別轉染。
[0104] 2、利用QPCR實驗檢測S iRNA的干擾效率。
[0105] 2.1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。
[0106] 2.2逆轉錄
[0107] 利用TAKARA公司的逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄。
[010引 2.3 QPCR
[0109] (1)引物設計
[0110] 根據Genbank中SENP3基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海生 工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0111] 沈 NP3 基因：
[0112] 正向引物為5'-CATATTGCCAAGTATCTAC-3'（沈Q ID N0.3);
[0113] 反向引物為5'-GTCACTGTCATTATTCTG-3'（沈Q ID N0.4),
[0114] GAro 蠟因：
[0115] 正向引物為5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0116] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0117] (2)按照表1配審化CR反應體系：
[011引其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0119] 表1 PCR反應體系 rni9ni
[0121] (3)PCR反應條件：95°CIOmin，（95°C 15s，60°C40s)*45個循環(huán)。Wsybr Green作為 巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，A A CT法進行相對定量。
[0122] 2.4統(tǒng)計學方法
[0123] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾SENP3基因表達組與對照組之間的差異采 用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[0124] 2.5 結果
[0125] 結果如圖3所示，與siRNA2-沈NP3、siRNA3-沈NP3相比，siRNAl-SENP3能夠更有效 的抑制SENP3基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，使用siRNAl-SENP3進行后續(xù)的實 驗。
[01%] 3、Western blot實驗檢測SiRNAl-沈NP3的干擾效率 [0127] 步驟同實施例2。
[012引結果如圖4所示，與轉染SiRNA-NC組相比，轉染SiRNAl-SENPS的細胞中沈NP3蛋白 的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
[0129] 實施例4 SENP3基因的表達對食管癌細胞增殖能力的測定
[0130] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)試劑盒用于檢測食管癌細胞增殖
[0131] 1、步驟
[0132] 按照前面實施例的方法進行食管癌細胞的培養(yǎng)和轉染，細胞分為二個實驗組：
[0133] 組1:轉染SiRNA-NC細胞組；
[0134] 組2:轉染SiRNAl-沈NP3細胞組。
[0135] 轉染2地后，W2.5 XioVml密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個實驗組設計=復 孔，每孔加入IOyl的CCK-8溶液，37°C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中解育4h;然后按照試劑盒說明，選擇 450nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值(OD值）。
[0136] 2、統(tǒng)計學方法
[0137] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[013引3、結果
[0139] 結果如表2所示，與轉染SiRNA-NC組相比，轉染siRNAl-SENP3細胞組細胞增殖緩 慢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇.05)。上述實驗結果表明，沈NP3基因表達促進了食管癌細胞 的增殖。
[0140] 表2食管癌細胞OD值 「ni/M 1 10142」實施例5食管癌細胞抗體中和實驗
[0143] 1、步驟：
[0144] 將食管癌細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個細胞/孔/200iU，細胞貼壁 后進行如下處理：
[0145] 實驗組1(對照組）：食管癌細胞中加入無關單抗(1:50);
[0146] 實驗組2:食管癌細胞中加入抗人沈NP3單抗(1:50)。
[0147] 將細胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育24小時后，加入化-TdRQ此i/孔），再培養(yǎng)24小 時，收集細胞，加液體閃爍液，的十數(shù)儀檢測cpm值。
[014引2、統(tǒng)計學方法
[0149]實驗都是按照重復3次來完成的，結果數(shù)據都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[01加 ]3、結果
[0151] 結果如圖5所示，相比于對照組，加入抗人SENP3單抗的細胞組細胞增殖減緩。上述 實驗結果表明，抑制SENP3蛋白的功能可W抑制食管癌細胞增殖。
[0152] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測SENP3基因表達的產品在制備診斷食管癌的工具中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測SENP3基因表達以診斷食管癌的產品；所 述用RT-PCR診斷食管癌的產品至少包括一對特異擴增SENP3基因的引物;所述用實時定量 PCR診斷食管癌的產品至少包括一對特異擴增SENP3基因的引物;所述用免疫檢測診斷食管 癌的產品包括:與SENP3蛋白特異性結合的抗體;所述用原位雜交診斷食管癌的產品包括： 與SENP3基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管癌的產品包括:蛋白芯片和基因 芯片;其中，蛋白芯片包括與SENP3蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與SENP3基因的核 酸序列雜交的探針。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷食管癌的產品至 少包括的一對特異擴增SENP3基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。4. 一種診斷食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測SENP3基因表達的試劑；所 述試劑包括檢測SENP3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測SENP3蛋白的抗體。5. 根據權利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測SENP3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對。 6. SENP3基因和/或其表達產物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制SENP3基因表達的試 劑、和/或抑制SENP3基因表達產物的試劑。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述抑制SENP3基因表達產物的試劑包括 抑制針對SENP3基因的s iRNA、和/或SENP3蛋白的抗體。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述針對SENP3基因的siRNA序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。10. -種用于治療食管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求6-9中任一項所述的抑制劑。
【文檔編號】A61K45/00GK105861741SQ201610472221
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】田子強, 溫士旺, 蘇鵬, 徐延昭
【申請人】河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院