串聯(lián)hcv多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒制備和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法采用將目的基因嵌合于HBV S的氨基端胞外區(qū)而不改變其穿膜結(jié)構(gòu)域(TMD)的方式，將HCV中和抗原表位串聯(lián)后嵌合于HBV S抗原氨基端，構(gòu)建丙型肝炎病毒串聯(lián)多中和抗原表位與乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察其在293T細(xì)胞的表達(dá)，制備嵌合HCV串聯(lián)多中和抗原表位的HBV S抗原的VLPs。該病毒樣顆粒免疫血清對(duì)體外模擬HCV感染具有一定的保護(hù)作用，為設(shè)計(jì)HCV中和抗體疫苗提供了新的技術(shù)方法，也為設(shè)計(jì)雙價(jià)疫苗提供了思路。
【專利說明】
串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒制備和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種串聯(lián)HCV多中和抗原表 位嵌合病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥V感染導(dǎo)致的慢性肝病是全球性的公共衛(wèi)生問題，全世界每年因肥V感染導(dǎo)致的 死亡人數(shù)達(dá)到45萬(wàn)。由于長(zhǎng)期缺乏合適的體外病毒培養(yǎng)系統(tǒng)、小動(dòng)物模型和準(zhǔn)確的中和抗 體評(píng)價(jià)方法，使肥V預(yù)防疫苗的研制至今未能獲得成功。研究表明，HCV包膜蛋白E1/E2區(qū)存 在多個(gè)保守的中和性抗原表位，針對(duì)運(yùn)些表位的單克隆抗體具有廣譜的交叉中和活性，運(yùn) 也為設(shè)計(jì)誘導(dǎo)中和抗體的預(yù)防性表位疫苗提供了新的思路。
[0003] 近年來(lái)報(bào)道較多的具交叉中和活性的單克隆抗體AP33,其抗原決定簇是E2的一個(gè) 保守的線性中和表位(412-423)，該單克隆抗體能顯著降低所有基因型HC化P的感染性。從 感染化型肥V患者得到的單抗A8(523-535)，其對(duì)應(yīng)表位是E2-CD81相互作用中起關(guān)鍵作用 的表位。針對(duì)E1區(qū)的中和表位(313-327)的單抗能強(qiáng)烈中和la，化，4a，5a，和6a型肥V包膜糖 蛋白制備的HCVpp。為克服HCV E2區(qū)高變異，可采用HVR1的模擬表位，其抗原性更強(qiáng)、更廣 譜。如報(bào)道的氨基酸序列為:ETYVSGGSAARNAYGLT化FTVGPAQK的模擬表位，可與80 %的肥V感 染患者血清反應(yīng)。將具有廣譜作用的表位串聯(lián)，制備多表位疫苗，可有效預(yù)防多種基因型和 準(zhǔn)種的病毒感染。
[0004] 皿V小包膜蛋白S抗原化BV S)長(zhǎng)度為226個(gè)氨基酸，是目前商品化皿V疫苗的主要 成分。S基因可在無(wú)核屯、蛋白和基因組參與下自我裝配成病毒樣顆粒，運(yùn)種特殊的亞病毒顆 粒，能產(chǎn)生大小為22nm的絲狀或球狀顆粒。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成與野生型病毒相似的病 毒顆粒，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，所形成的病毒顆粒是非傳染性的。用皿V S作為表達(dá)載體 表達(dá)外源蛋白，具有易制備、易純化等特點(diǎn)，而且外源抗原與之嵌合后，可增強(qiáng)外源蛋白的 免疫原性。因此皿V S是一種較好的載體系統(tǒng)。皿V S抗原親水區(qū)，可插入表位，嵌和表達(dá)病 原體保守的表位，但研究發(fā)現(xiàn)，親水區(qū)插入表位長(zhǎng)度超過36個(gè)氨基酸就影響病毒顆粒的包 裝。而皿V S得氨基端可插入較大片段(如GFP)，可形成嵌合的病毒樣顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒及其制備方 法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒是將串聯(lián)的HCV多中 和抗原表位嵌合于皿V S抗原氨基端構(gòu)建得到真核表達(dá)載體，再經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外裝配 制得；
[000引其中，所述串聯(lián)的肥V多中和抗原表位的核巧酸序列如SEQ. ID. NO: 1所示。
[0009] 所述串聯(lián)的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ.ID.no. 2、SEQ. ID.NO. 3、 SEQ. ID. NO. 4及沈Q. ID. NO. 5所示的表位串聯(lián)得到。
[0010] 氨基酸序列如SEQ.ID.no. 2所示的表位為HCV El區(qū)線性中和表位;氨基酸序列如 SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4所示的表位為HCVE2區(qū)線性中和表位；氨基酸序列如 869.10.^.5所示的表位為肥￥62高變區(qū)模擬表位。
[0011] 串聯(lián)的HCV多中和抗原表位的堿基序列全長(zhǎng)25加 P，各個(gè)表位間WAAY為間隔進(jìn)行 連接。
[0012] 本發(fā)明還公開了一種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備方法，包括 W下步驟：
[OOU] 1)利用DM W0服S設(shè)計(jì)合成，并擴(kuò)增得到串聯(lián)的肥V多中和抗原表位基因序列； [0014] 2)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到去除胞外區(qū)的皿V S基因；
[0015] 3)將串聯(lián)的肥V多中和抗原表位基因和去除胞外區(qū)的皿VS基因克隆入真核表達(dá)載 體；
[0016] 4)經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外裝配，制備得到串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒。
[0017] 串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備方法，包括W下步驟：
[001引步驟1)，根據(jù)DNA W0服S設(shè)計(jì)合成表位基因序列Mixl~Mix6, WMixl~Mix6混合物 為模板，Mixl和Mix6為上下游引物，擴(kuò)增得到串聯(lián)多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy 載體，經(jīng)化0 I、EcoR I雙酶切鑒定正確后，命名為Τ-ΜΕρ;
[0019] 步驟2)，W含有完整皿V S基因的質(zhì)粒地V皿S為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增6-226位氨基 酸的堿基序列，得到S，兩端分別引入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，克隆至T-easy載體，Eco RI 和Not I雙酶切鑒定正確后，命名為T-HBVS;
[0020] 步驟3)，將T-HBVS用Eco R I/Not I雙酶切，將Τ-ΜΕρ用化〇 I/EcoR I雙酶切后，與 化0 I/Not I酶切的pCI-neoS片段連接，串聯(lián)多中和抗原表位與截去胞外區(qū)的皿V S嵌合 的重組真核表達(dá)載體pCI-MEpS，然后將該重組真核表達(dá)載體pCI-MEpS轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)口， 篩選陽(yáng)性克隆，提取pCI-MEpS質(zhì)粒；
[0021] 步驟4)，將pCI-MEpS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4她后收集培養(yǎng)上清，濃縮純化 后制得串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒。
[0022] 本發(fā)明還公開了上述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒在制備用于預(yù)防 HCV感染疫苗中的應(yīng)用。
[0023] 所述的疫苗為嵌合病毒樣顆粒疫苗，用于HCV預(yù)防性疫苗的設(shè)計(jì)。由串聯(lián)HCV多中 和抗原表位嵌合病毒樣顆粒免疫動(dòng)物后產(chǎn)生保護(hù)性抗體，能夠抑制HCVpp感染化h7.5細(xì)胞。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0025] 本發(fā)明公開的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，采用將目的基因嵌合于 皿V S的氨基端胞外區(qū)而不改變其穿膜結(jié)構(gòu)域(TMD)的方式，將HCV中和抗原表位串聯(lián)后嵌 合于皿V S抗原氨基端，構(gòu)建丙型肝炎病毒串聯(lián)多中和抗原表位與乙型肝炎病毒S抗原嵌合 基因真核表達(dá)質(zhì)粒，在293T細(xì)胞表達(dá)，制備嵌合HCV串聯(lián)多中和抗原表位的皿V S抗原的 VLPs。該病毒樣顆粒對(duì)體外模擬HCV感染具有一定的保護(hù)作用，可W為制備雙價(jià)表位疫苗提 供借鑒，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)中和抗體疫苗提供了新的技術(shù)方法。
[0026] 本發(fā)明的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒制備簡(jiǎn)單，易于濃縮純化，制備 的病毒樣顆粒免疫新西蘭兔后，免疫抗血清具有一定的保護(hù)作用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為HCV多表位抗原與皿V S抗原嵌合示意圖；
[0028] 圖2為串聯(lián)HCV多中和表位的合成擴(kuò)增及皿V S基因的擴(kuò)增結(jié)果；
[0029] 圖3為串聯(lián)HCV多中和表位及皿V S基因胞基因 T載體的酶切鑒定結(jié)果；
[0030] 圖4為串聯(lián)HCV多中和表位及皿V S基因克隆入真核載體的酶切鑒定結(jié)果；
[0031] 圖5為重組真核表達(dá)載體在293T細(xì)胞中的表達(dá)分析；
[0032] 圖6為嵌合串聯(lián)HCV多中和抗原表位在真核細(xì)胞中表達(dá)分析Western blot結(jié)果；
[0033] 圖7為純化嵌合病毒樣顆粒電鏡分析結(jié)果;其中，A為分段測(cè)定皿sAg含量結(jié)果;B為 乙肝疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照的皿sAg含量測(cè)定結(jié)果;C為電鏡下觀察病毒樣顆粒；
[0034] 圖8病毒樣顆粒免疫新西蘭兔后血清抗體分析;其中，A為化Ps-MEpS組抗血清抗體 水平與VLPs-HBS，化ccine及佐劑對(duì)照組抗體的水平;B為檢測(cè)皿V S抗原載體的免疫性；
[0035] 圖9免疫血清對(duì)HCVpp感染化h7.5抑制作用分析;其中，A為各組中和率比較結(jié)果;B 為免疫后42天和免疫前0天中和率比較結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0037] 采用將目的基因嵌合于皿V S的氨基端胞外區(qū)而不改變其穿膜結(jié)構(gòu)域(TMD)的方 式，將HCV中和抗原表位串聯(lián)后嵌合于皿V S抗原氨基端，構(gòu)建丙型肝炎病毒串聯(lián)多中和抗 原表位與乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察其在293T細(xì)胞的表達(dá)，制備嵌合 HCV串聯(lián)多中和抗原表位的皿V S抗原的VLPs。
[0038] 1、串聯(lián)丙型肝炎病毒多中和抗原表位基因選擇及合成
[0039] 1.1表位選擇包括：
[0040] HCV E1 區(qū)線性中和表位:ITGHRMAWDMMMNWS;
[0041 ] HCV E2區(qū)線性中和表位:QLINTNGSWHIN;
[0042] HCV E2區(qū)線性中和表位:GVPTYSWGE肥T;
[0043] HCV E2高變區(qū)化VR)模擬表位：
[0044] ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。
[0045] 具體參見下表1:
[0046] 表1.表位選擇及在HCV中的氨基酸位置
[0047]
[004引 1.2DNA wo服S設(shè)計(jì)合成串聯(lián)的多表位基因
[0049]表位間WAAY為間隔進(jìn)行連接，表位堿基序列全長(zhǎng)25化P，根據(jù)DNA W0服S設(shè)計(jì)合成 表位基因序列Mixl-Mix6(參見表2):
[(X)加]表2.DNA W0服S設(shè)計(jì)合成串聯(lián)多表位基因 Μ邱序列
[0化1 ]
[0化2] WMixl-6混合物為模板，Mixl和Mix6為上下游引物，擴(kuò)增得到串聯(lián)表位序列ΜΕρ， 兩端分別帶有化0 I、EcoR I酶切位點(diǎn)和HIS，擴(kuò)增后得到帶有HIS標(biāo)簽的串聯(lián)表位序列ΜΕρ， 參見圖2。克隆至T-easy載體，化0 I、EcoR I雙酶切鑒定正確后，參見圖3,送測(cè)序。測(cè)序正確 后。命名為THVtep。
[0化3] 2、皿V S基因胞外區(qū)擴(kuò)增
[0054] W含有完整皿V S基因的質(zhì)粒pBV皿S為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增6-226位氨基酸的堿 基序列，得到S，兩端分別引入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，參見圖2?？寺≈罷-easy載體，Eco RI和Not I雙酶切鑒定正確，參見圖3，送測(cè)序，測(cè)序正確后，命名為T-HBVS。
[0055] 從圖2中可W看出，擴(kuò)增出66化p和25化p大小的目的片段，與去除胞外區(qū)的皿V S 基因和串聯(lián)多表位基因（MEp)大小相符。從圖3中可W看出，瓊脂糖凝膠電泳分析，分別用 EcoR I/Not 1(截短皿V S)和)(hoI/EcoRI(MEp)酶切得到大小分別為666bp、25化P的預(yù)期片 段，測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增序列正確。
[0056] 3、將串聯(lián)HCV多中和抗原表位基因和皿V S胞外區(qū)克隆入真核表達(dá)載體
[0057] 將T-HBVS用Eco R I/Not I雙酶切、Τ-ΜΕρ用化〇 I/EcoR I雙酶切后，與趾0 I/Not I酶切的pCI-neoS片段連接，串聯(lián)多中和抗原表位與截去胞外區(qū)的皿V S嵌合的重組真核 表達(dá)載體pCI-M化S，設(shè)計(jì)方式見圖1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用趾0 I/Not I雙酶切鑒定，結(jié)果參見圖4,重組克隆質(zhì)粒pCI-MEpS經(jīng)趾0 I/Not I雙酶切后，瓊脂 糖凝膠電泳分析，可見92化P，大小與預(yù)期一致。不含Μ巧的真核表達(dá)載體為對(duì)照(pCI-HBS)。 [005引 4、串聯(lián)HCV多中和抗原表位基因與皿V S嵌合基因表達(dá)分析
[0059] 4.1嵌合基因真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中的表達(dá)分析(IFA)
[0060] 將5 X 105HEK293T細(xì)胞接種放入蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h。將7 . 5ul Lipof ectamine 2000用12加1稀釋，放置5min，將2.加 g的pCI-MEpS質(zhì)粒用12加1稀釋，5min 后將二者混合解育20min，緩慢加入6孔板中。37°C，5%C02解育化后，更換為完全培養(yǎng) 基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，取出蓋玻片，PBS洗2遍;加入500ul 4%多聚甲醒固定10min;PBS漂洗3 次，3min/次;0.2 % 的PBST漂洗1次，lOmin; PBS漂洗3次，5min/次；3 % 的BSA封閉化；1 %BSA 稀釋的一抗化IS單抗，l:1000;HbsAb陽(yáng)性血清l:200)，37°C解育化；PBST漂洗3次，每次 5min; 1 %BSA稀釋的二抗（1:2000)，37°C避光封閉化;PBS漂洗3次，每次5min，洗完后，中性 樹脂封片，巧光顯微鏡下觀察，結(jié)果參見圖5，重組真核表達(dá)載體在293T細(xì)胞中的表達(dá)分析。 HIS單抗作為一抗:pCI-MEpS轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較強(qiáng)的綠色巧光，而對(duì)照pCI-HBS、 pCI-neo未見綠色巧光。皿V抗血清作為一抗:pCI-MEpS和pCI-HBS可見綠色巧光，pCI-neo未 見綠色巧光。
[0061 ] 4.2嵌合基因真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中的表達(dá)分析(Western)
[0062] 將5X105皿K293T細(xì)胞接種6孔板中，培養(yǎng)2地。將7.5ul Lipofectamine 2000用 125ul稀釋，放置5min，將2.5ug的pCI-MEpS質(zhì)粒用125ul稀釋，5min后將二者混合解育 20min，緩慢加入6孔板中。37 °C，5 % C02解育化后，更換為完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24- 4她。取部分轉(zhuǎn)染24-4化的細(xì)胞，RIPA裂解，在冰上作用30-40min后，刮取裂解液，12000巧m 離屯、lOmin留取上清。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜;5%脫脂奶粉封閉1-化； 加入相應(yīng)一抗化IS單抗，1:2000;皿sAg單克隆抗體1:1000)4°C振蕩解育過夜;TBST洗3次， 15min/次;加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG( 1:5000稀釋)或羊抗鼠 IgG( 1:8000稀釋），室溫振蕩解 育1-化;TBST洗3次，15min/次，E化發(fā)光。WpCI-neo，pCI-HBVS作為對(duì)照，結(jié)果參見圖6，從圖 中可W看出，HIS單抗作為一抗:檢測(cè)結(jié)果顯示pCI-MEpS轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞在相對(duì)分子質(zhì)量約 38KD處可見蛋白條帶，而pCI-皿S和空載體pCI-neo未見條帶；HBsAg單抗作為一抗：pCI- MEpS和pCI-HBS轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞在相對(duì)分子質(zhì)量約27KD處可見蛋白條帶，而pCI-neo未見條 帶。
[0063] 5、病毒樣顆粒的制備及純化
[0064] 5.1培養(yǎng)細(xì)胞
[0(?日]將lX10?EK29：3T細(xì)胞接種75ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)至95%密度時(shí)，按4 中方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體和載體濃度按轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，4化后收集培養(yǎng)上清，上清中 即含有自我裝配的嵌合的病毒樣顆粒化Ps-MEpS。羅氏E601電化學(xué)發(fā)光分析儀上對(duì)皿sAg進(jìn) 行定量，測(cè)定皿sAg含量。
[0066] 5.2嵌合￥1?3濃縮和純化
[0067] 將收集的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清（約15ml)，用Amicon嚴(yán)叫1：racell-l5 100k離屯、過 濾器4000g離屯、15min，濃縮的化Ps (約800μ1)分別鋪于60%-20%密度梯度的薦糖上， Beckman超速離屯、機(jī)(rotor SW41 )28000rpm超速離屯、16h;從管低依次收集不同片段（1ml/ 片段），用商品化乙肝表面抗原測(cè)定試劑在羅氏E601電化學(xué)發(fā)光分析儀上對(duì)皿sAg進(jìn)行定 量，結(jié)果參見圖7A，合并陽(yáng)性片段進(jìn)行透析（20mMTris-HCl)并用離屯、過濾器濃縮，得到約 300μ1純化濃縮的化Ps，結(jié)果參見圖7B。取20μ1進(jìn)行電鏡分析，結(jié)果參見圖7C，剩余-80°C凍 存。純化嵌合病毒樣顆粒電鏡分析結(jié)果。真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞48小時(shí)后，收集培養(yǎng) 上清，濃縮離屯、，薦糖滴度密度離屯、，分段檢測(cè)皿sAg含量。結(jié)果第6和第7片段皿sAg含量最 高（圖7A)。取兩片段混合透析，濃縮后測(cè)定皿sAg含量，結(jié)果pCI-MEpS轉(zhuǎn)染組皿sAg含量可達(dá) 3 X 103ng/ml，pCI-MEpS轉(zhuǎn)染組皿sAg含量可達(dá)8 X 103ng/ml。乙肝疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照（圖7B， 皿sAg標(biāo)準(zhǔn)含量為20X 103ng/ml)。取20ul濃縮的病毒樣顆粒，1%鋼酸錠負(fù)染電鏡下觀察， 可見大量病毒樣顆粒(圖7C，放大倍數(shù)15萬(wàn)倍）。
[0068] 6純化病毒樣顆粒免疫新西蘭兔抗血清測(cè)定及保護(hù)力評(píng)價(jià)
[0069] 6.1病毒樣顆粒免疫新西蘭兔方法
[0070] 將15只新西蘭兔分為5組，每組3只，分別命名為化Ps-MEpS、VLPs-HBS、化ccine(乙 肝疫苗）、佐劑組、PBS組。分別取lOyg的純化化Ps和lOyg的Vaccine與同體積的MF59佐劑混 合成油包水狀后皮下多點(diǎn)免疫新西蘭兔，佐劑組用PB巧h齊。從第0天開始免疫，每隔兩周免 疫一次，共免疫Ξ次;不同的時(shí)間點(diǎn)采集免疫兔靜脈血，0、14、28、42、56和70天分別采血一 次。離屯、留取血清，分裝后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0071] 6.沈LISA法檢測(cè)免疫抗血清中抗體的水平
[0072] 四種合成膚分別用0.3%戊二醒和BSA交聯(lián)，包被交聯(lián)膚（四種交聯(lián)膚混合物)濃度 為16μg/ml，W每孔100μΙ包被，4°C過夜;PBST重復(fù)清洗3次，每孔加入PBST配制2%BSA封閉 液15化l，37°Clh;PBST重復(fù)清洗3次，加入免疫血清（1:200稀釋），每孔10化1，陰性對(duì)照不加 一抗，37 °C化;PBST重復(fù)清洗3次，加入二抗化RP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:4000稀釋），37 °C化； PBST重復(fù)清洗3次，每孔加入TMB顯色液10化1，37 °C顯色5-lOmin;加入終止液5化1; 30分鐘 內(nèi)酶標(biāo)儀450nm測(cè)定0D值。同樣方法用皿sAg陽(yáng)性血清（1:500稀釋)血清包被96孔板，測(cè)定免 疫血清中化sAb水平。抗體檢測(cè)結(jié)果見圖8, W收取血清的不同時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，ELISA檢測(cè) 結(jié)果0D值為縱坐標(biāo)作圖，分析不同組別中抗體的水平。圖8A中可見化Ps-MEpS組抗血清抗體 水平與化Ps-皿S，化ccine及佐劑對(duì)照組相比0D值有明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。圖 8B是W皿V表面抗原強(qiáng)陽(yáng)性血清包被抗原，檢測(cè)皿V S抗原載體的免疫性，可見化Ps-MEpS， 化Ps-HBS，Vaccine組均產(chǎn)生較高水平的皿sAb，與佐劑和PBS對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。
[0073] 6.3免疫抗血清對(duì)HCVpp感染化h7.5細(xì)胞的抑制性分析
[0074] 2X105/孔的化h7.5細(xì)胞接種于24孔板，37°C，5%C02條件下過夜培養(yǎng)。將不同分 組的免疫抗血清(預(yù)先56°C、30min滅活)從1:10開始進(jìn)行倍比稀釋，分別與含有2000TU(感 染后非抑制對(duì)照組GFP陽(yáng)性率達(dá)到50 %左右）的HCVpp (化型）等體積混合均勻，室溫Ih ;DMEM 清洗24孔板，將假病毒與抗血清混合物加到24孔板中，每孔約20化1。37°(：吸附1化后，更換 DMEM完全培養(yǎng)液;48~7化后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)表達(dá)EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞的比率。PBS組為非抑制 對(duì)照，計(jì)算免疫血清中和率。計(jì)算方法:計(jì)算中和抗體中和率(抑制率），計(jì)算方法：中和率 (% ) = ( % GFP礎(chǔ)深且-% GFP纖且)/ % GFP礎(chǔ)深且。
[00巧]血清抗體中和作用見圖9,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VLPs-MEpS組抗血清對(duì)lb型HCV卵感染 化h7.5的抑制作用，與對(duì)照組相比中和率明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),42天時(shí)最高中 和率可達(dá)61.5% (圖9A);免疫后(42天)與免疫前(0天）比較化Ps-MEpS組中和率明顯增高， 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖9B)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將串聯(lián) 的HCV多中和抗原表位嵌合于HBV S抗原氨基端構(gòu)建得到真核表達(dá)載體，再經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 體外裝配制得； 其中，所述串聯(lián)的HCV多中和抗原表位的核苷酸序列如SEQ. ID. NO: 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，其特征在于，所述串 聯(lián)的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2、SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4及 SEQ. ID. NO. 5所示的表位串聯(lián)得到。3. 如權(quán)利要求1所述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，其特征在于，氨基酸 序列如SEQ.ID.N0.2所示的表位為HCV E1區(qū)線性中和表位;氨基酸序列如SEQ.ID.N0.3和 SEQ. ID. N0.4所示的表位為HCV E2區(qū)線性中和表位;氨基酸序列如SEQ. ID. N0.5所示的表位 為HCV E2高變區(qū)模擬表位。4. 如權(quán)利要求1所述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒，其特征在于，串聯(lián)的 HCV多中和抗原表位的堿基序列全長(zhǎng)255bp，各個(gè)表位間以AAY為間隔進(jìn)行連接。5. -種串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 利用DNA WORKS設(shè)計(jì)合成，并擴(kuò)增得到串聯(lián)的HCV多中和抗原表位基因序列； 2) 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到去除胞外區(qū)的HBV S基因； 3) 將串聯(lián)的HCV多中和抗原表位基因和去除胞外區(qū)的HBVS基因克隆入真核表達(dá)載體； 4) 經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外裝配，制備得到串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒。6. 如權(quán)利要求5所述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： 步驟1)，根據(jù)DNA WORKS設(shè)計(jì)合成表位基因序列Mixl~Mix6,以Mixl~Mix6混合物為模 板，Mixl和Mix6為上下游引物，擴(kuò)增得到串聯(lián)多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy載體， 測(cè)序和經(jīng)Xho I、EcoR I雙酶切鑒定正確后，命名為Τ-ΜΕρ; 步驟2)，以含有完整HBV S基因的質(zhì)粒pBVHBs為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增6-226位氨基酸的 堿基序列，得到S，兩端分別引入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，克隆至T-easy載體，測(cè)序和經(jīng)Eco RI和Not I雙酶切鑒定正確后，命名為T-HBVS; 步驟3)，將T-HBVS用Eco R I/Not I雙酶切，將Τ-ΜΕρ用Xho I/EcoR I雙酶切后，與Xho I/Not頂每切的pCI-neo三片段連接，串聯(lián)多中和抗原表位與截去胞外區(qū)的HBV S嵌合的重 組真核表達(dá)載體pCI-MEpS，然后將該重組真核表達(dá)載體pCI-MEpS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選 陽(yáng)性克隆，提取pCI-MEpS質(zhì)粒； 步驟4)，將pCI-MEpS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集培養(yǎng)上清，制得串聯(lián)HCV多 中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒。7. 權(quán)利要求1所述的串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒在制備用于預(yù)防HCV感染 的疫苗中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗為預(yù)防性疫苗，由串聯(lián)HCV多中和 抗原表位嵌合病毒樣顆粒免疫動(dòng)物后產(chǎn)生保護(hù)性抗體，能夠抑制HCVpp感染Huh7.5細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C07K14/18GK106011089SQ201610332980
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月18日
【發(fā)明人】韋三華, 王曉巖, 張海, 雷迎峰, 林芳, 崔穎, 李斌, 張惠中
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)