一種高通量過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒主要包括：固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，多聚酶標(biāo)記的鏈霉親和素，以及與多聚酶對應(yīng)的顯色劑；所述人IgE抗體為羊抗人IgE抗體或兔抗人IgE抗體，所述多聚酶為多聚堿性磷酸酶或多聚辣根過氧化物酶。本發(fā)明試劑盒可定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體IgE濃度，并可一次篩查數(shù)十種過敏原，快速、準(zhǔn)確、樣品用量少，適宜進(jìn)行高通量檢測。
【專利說明】-種高通量過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒及檢測方法 (-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高靈敏地定性或半定量地篩査或檢測人血清或血漿中的多個過 敏原特異性I班抗體水平的檢測試劑盒及檢測方法。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 2011?2012年世界變態(tài)反應(yīng)組織（WAO)關(guān)于變態(tài)反應(yīng)(也稱過敏反應(yīng)，Allergy) 的白皮書指出："過敏性疾病的流行在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家全世界范圍內(nèi)正戲劇性地上 升。過敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、嚴(yán)重過敏反應(yīng)，藥物、食物及昆蟲過敏反應(yīng)， 濕疹、専麻疹(枯草熱）和血管性水腫。過去二十年尤其是兒童患過敏性疾病人數(shù)的增加有 暴發(fā)的趨勢。"（Pawankar R et al, WAO White Book on Allergy 2011-2012:Executive Summary.)僅食物引發(fā)的過敏性疾病的流行率就達(dá)3%?6%。（Sicherer S H, !Epidemiology of food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2011;127:594-602.)過敏性疾病是患者吸 入或攝食入含有致敏成分的物質(zhì)(稱為過敏原或變應(yīng)原，Allergen)后觸發(fā)機(jī)體的B細(xì)胞 產(chǎn)生過量的免疫球蛋白E (Immunoglobulin E，I班），當(dāng)I班抗體在體內(nèi)再次接觸過敏原 時就與過敏原交聯(lián)結(jié)合到服大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面上的高親和受體化￡ Rl上，導(dǎo)致 化￡ Rl受體的聚集，使服大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞活化。服大細(xì)胞在活化過程中脫顆粒并釋 放儲存在細(xì)胞漿顆粒里的炎性介質(zhì)：組胺，與通過花生四帰酸途徑合成的白H帰、免疫反應(yīng) 性前列腺素和IL4、IL5等細(xì)胞因子及趨化因子，引發(fā)過敏反應(yīng)的疾病癥狀。過敏性疾病的 發(fā)生，I班抗體起關(guān)鍵作用，稱為I班介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。I班介導(dǎo)的過敏性疾病的特征是患 者體內(nèi)循環(huán)血液中的過敏原特異性I班（SlgE)抗體濃度較正常狀況下高，且病癥越嚴(yán)重， si班抗體濃度越高。（Bloebaum R M et al, 2004, Mechanisms of I班-mediated allergic reactions, IniLockey RF et al ed,Allergens and allergen immunotherapy， Marcel Dekker，Inc, New York, USA, PP65-84.)
[0003] 過敏性疾病的臨床診斷在美國臨床醫(yī)師實(shí)用指南中指出，根據(jù)患者病史結(jié) 合點(diǎn)刺或血液檢測過敏原特異性I班（Si班）抗體濃度，篩查致病過敏原（Siles R I,Hsieh F H, Allergy blood testing:A practical guide for clinicians. Am Clin J Medicine. 2011;78:585-592.)。目前，檢測血液中過敏原特異性I濁（si濁）抗體濃度， 篩查致病過敏原的方法有酶免疫法（EIA)、免疫印跡法（Immunoblotting Assay)、膠體金 側(cè)流層析法化FA)、蛋白芯片法（Proteins microarray)等，發(fā)展趨勢并符合市場要求的 是：自動化、快速、準(zhǔn)確、樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原。市場上產(chǎn)品不少，其中，瑞典 Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP 250系統(tǒng)是酶免疫法的代表，ImmunoCAP Rapid是膠體金 側(cè)流層析法的代表，ImmunoCAP ISAC是蛋白芯片法的代表，開創(chuàng)了過敏原分子診斷；而德 國Mediwiss-anal}ftic公司的AllergyScreen則是免疫印跡法的代表（AlleisaScreen⑩ Immunoblot for analysing specific IgE in human serum)。為滿足自動化、快速、準(zhǔn)石角、 樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原，半定量或定量檢測樣品中的過敏原特異性I班(si班） 抗體濃度的要求，它們均配置了檢測儀。瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP Rapid -次 只能篩查十來種過敏原，不配閱讀儀，肉眼判讀Si班抗體濃度的靈敏度只有I. OlU/ml，用 1. 49IU/ml區(qū)分陰性和陽性結(jié)果。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種高通量過敏原特異性抗體I班檢測試劑盒(免疫印跡法)， 用W定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體I班濃度，并可一次篩 查數(shù)十種過敏原。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種高通量過敏原特異性抗體I班檢測試劑盒，主要包括；固化有待測過敏原 蛋白的纖維材料膜，生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體(使用時可用抑7. 4的PBS配制成濃度 1:100?10000的工作液)，多聚酶標(biāo)記的鏈霉親和素(使用時可用抑7. 4的PBS配制成濃度 1:5000?50000的工作液)，W及與多聚酶對應(yīng)的顯色劑(可市購獲得，也可W抑7. 4的PBS 為溶劑自行配制）；所述人I班抗體為羊抗人I班抗體或兔抗人I班抗體，所述多聚酶為多 聚堿性磯酸酶或多聚辣根過氧化物酶。上述為試劑盒的主要成分，不包含檢測所用的常規(guī) 試劑如稀釋液、洗涂液等。
[0007] 所述纖維材料膜為硝酸纖維素膜，混合纖維素醋膜或者多孔PVF膜等，具有足夠 抗彎曲和抗折皺機(jī)械強(qiáng)度，固化待測過敏原蛋白后固置于反應(yīng)槽內(nèi)。纖維材料膜隨需固化 的過敏原蛋白不同，可分別采用漠化膳、戊二酵、駿基變性、氨基變性、氯甲基變性等方法活 化纖維材料膜，使之能共價結(jié)合足量（0. 2?2. Oug)的相應(yīng)的過敏原蛋白，W便能充分結(jié)合 樣品液中的Si班抗體，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。所述過敏原蛋白可按常規(guī)方法從下列天然 原材料中提取，包括：植物花粉類(樹花粉類、草花粉類及野草花粉類等）過敏原；霉菌類過 敏原；動物皮屑類過敏原；昆蟲類過敏原；植物食物類(包括水果類、蔬菜類、堅(jiān)果類、食用 菌類及谷物類）過敏原和動物食物類(包括肉類、禽蛋類、魚和甲殼類及奶類）過敏原等。
[0008] 本發(fā)明試劑盒同時使用生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體捕獲劑溶液和多聚酶標(biāo)記的 鏈霉親和素溶液，既具生物素-鏈霉親和素的生物放大系統(tǒng)，又具多聚酶-顯色放大作用， 極大提高檢測靈敏度。
[0009] 優(yōu)選的，所述多聚酶為多聚堿性磯酸酶，對應(yīng)的顯色劑為硝基四氮哇蘭和 5-漠-4-氯-3-日引巧磯酸的混合物（NBT/BCIP，Nit;roblueTetrazolium/5-B;romo-4-chlor o-3-Indolyl Phosphate),或?qū)κせ桨罚╬-nitrophenyl phosphate)。
[0010] 或者，所述多聚酶為多聚辣根過氧化物酶，對應(yīng)的顯色劑為3, 3'，5, 5'-四甲基 聯(lián)苯胺（TMB, Tetramethy化enzidine),鄰苯二胺（O-Phenylenediamine),聯(lián)苯二胺（DAB, 3,3' -diaminobenzidine tetrahydrochloride),或者過氧化尿素。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種利用所述試劑盒高通量檢測過敏原特異性抗體I班的方法，所 述包括：
[0012] (1)取內(nèi)壁貼有固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜的反應(yīng)槽，室溫下水平放置， 備用；
[0013] (2)將200?400微升血清或血漿加入反應(yīng)槽的加液孔內(nèi)，再加入樣品稀釋液，3? 6分鐘后將反應(yīng)槽置于混勻器上，室溫賠育30?60分鐘；所述樣品稀釋液為常規(guī)含有新生 牛血清的緩沖液；
[0014] (3)用洗涂液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30砂；所述洗涂液為 常規(guī)含有表面活性劑(如吐溫-20)的洗涂液；
[0015] (4)加200?400微升生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體工作液入反應(yīng)槽內(nèi)，置于混勻器 上室溫賠育30?60分鐘；
[001引（5)用洗涂液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30砂；
[0017] (6)在反應(yīng)槽內(nèi)加入200?400微升多聚酶標(biāo)記鏈霉親和素的工作液，置于混勻器 上室溫賠育15?30分鐘；
[001引（7)用洗涂液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30砂；
[0019] (8)在反應(yīng)槽內(nèi)加入200?400微升顯色劑溶液，置于混勻器上室溫賠育10?30 分鐘；
[0020] ( 9 )流水沖洗終止酶反應(yīng)；
[0021] (10)將反應(yīng)槽與比色卡比對判讀，或者用閱讀儀進(jìn)行判讀。
[0022] 所述比色卡可依據(jù)國際通用的血清中特異性抗體I班濃度0?6級分級方法制 作，形式可W是長條形、正方形、H角形及圓形等。顏色隨顯色劑不同，可W是黃色、蘭色和 黑色等，但色彩的強(qiáng)度必須按國際通用的血清中特異性抗體I班濃度0?6級要求一致。
[0023] 按照本發(fā)明方法，采用比色卡或不用帶數(shù)據(jù)處理功能的閱讀儀，根據(jù)操作步驟操 作，就可方便地用肉眼定性或半定量地判讀檢測人血清或血漿中的多個過敏原特異性I班 抗體水平；使用帶數(shù)據(jù)處理功能的閱讀儀，可定量地檢測人血清或血漿中的多個過敏原特 異性I班抗體濃度。
[0024] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在；本發(fā)明試劑盒可定性或半定量地快速檢測人血清 或血漿中的過敏原特異性抗體I班濃度，并可一次篩查數(shù)十種過敏原，快速、準(zhǔn)確、樣品用 量少，適宜進(jìn)行高通量檢測。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為實(shí)施例1所用反應(yīng)槽結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026] 圖2為依據(jù)國際通用的血清中特異性抗體I班濃度0?6級分級方法制作的比色 卡（TMB顯色）圖例。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0028] 實(shí)施例1 :
[0029] (1)預(yù)處理：取出實(shí)驗(yàn)所需檢測反應(yīng)槽(結(jié)構(gòu)參見圖1，內(nèi)壁已貼有固化有待測過 敏原蛋白的纖維材料膜)，室溫下水平放置，編號或標(biāo)記患者姓名；
[0030] (2)初次賠育：將300微升血清加入加液孔內(nèi)，再加入樣品稀釋液（pH7. 4的 PBS+10%新生牛血清)，5分鐘后將反應(yīng)槽置于混勻器上，室溫（20?25C )賠育45分鐘。
[0031] (3)清洗；用洗涂液（pH7. 4的PBS+0. 05%吐溫-20)沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗5次， 每次10砂鐘；沖洗時，使洗涂液充分流過反應(yīng)槽。注意傾倒洗涂液時讓液體順著反應(yīng)槽流 下，避免交叉污染。
[0032] (4)第二次賠育；加6滴(約300微升)生物素偶聯(lián)的兔抗人I班抗體工作液(溶劑 為抑7. 4的PBS，濃度1:10000)入反應(yīng)槽內(nèi)，置于混勻器上室溫（20?25C )賠育45分鐘。
[0033] (5)清洗；過程同步驟（3)。
[0034] (6)第H次賠育：在反應(yīng)槽內(nèi)加入6滴多聚辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素的 工作液(溶劑為抑7. 4的PBS，1:50000)，置于混勻器上室溫（20?25°C)賠育20分鐘。
[00巧](7)清洗；過程同步驟（3)。
[0036] (8)第四次賠育；在反應(yīng)槽內(nèi)加入6滴TMB顯色溶液（sigma公司），置于混勻器上 室溫（20?25 to賠育20分鐘。
[0037] (9)終止反應(yīng)：流水沖洗終止酶反應(yīng)。
[0038] (10)讀數(shù)；將反應(yīng)槽與比色卡（TMB顯色的比色卡參見圖2)比對判讀。
[0039] 按照上述方法，可方便地用肉眼定性或半定量地判讀檢測人血清中的多個過敏原 特異性I班抗體水平。
【權(quán)利要求】
1. 一種高通量過敏原特異性抗體IgE檢測試劑盒，主要包括：固化有待測過敏原蛋白 的纖維材料膜，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，多聚酶標(biāo)記的鏈霉親和素，以及與多聚酶對應(yīng) 的顯色劑；所述人IgE抗體為羊抗人IgE抗體或兔抗人IgE抗體，所述多聚酶為多聚堿性磷 酸酶或多聚辣根過氧化物酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述多聚酶為多聚堿性磷酸酶，對應(yīng)的顯 色劑為硝基四氮唑蘭和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的混合物，或?qū)ο趸桨贰?br> 3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述多聚酶為多聚辣根過氧化物酶，對應(yīng) 的顯色劑為3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺，鄰苯二胺，聯(lián)苯二胺，或者過氧化尿素。
4. 利用權(quán)利要求1所述試劑盒高通量檢測過敏原特異性抗體IgE的方法，所述包括： (1) 取內(nèi)壁貼有固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜的反應(yīng)槽，室溫下水平放置，備 用； (2) 將200?400微升血清或血漿加入反應(yīng)槽的加液孔內(nèi)，再加入樣品稀釋液，3?6 分鐘后將反應(yīng)槽置于混勻器上，室溫孵育30?60分鐘； (3) 用洗滌液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30秒； (4) 加200?400微升生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體工作液入反應(yīng)槽內(nèi)，置于混勻器上室 溫孵育30?60分鐘； (5) 用洗滌液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30秒； (6) 在反應(yīng)槽內(nèi)加入200?400微升多聚酶標(biāo)記鏈霉親和素的工作液，置于混勻器上室 溫孵育15?30分鐘； (7) 用洗滌液沖洗液反應(yīng)槽，重復(fù)清洗3?5次，每次10?30秒； (8) 在反應(yīng)槽內(nèi)加入200?400微升顯色劑溶液，置于混勻器上室溫孵育10?30分 鐘； (9) 流水沖洗終止酶反應(yīng)； (10) 將反應(yīng)槽與比色卡比對判讀，或者用閱讀儀進(jìn)行判讀。
【文檔編號】G01N33/548GK104237523SQ201310238139
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】吳善東 申請人:杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司