本發(fā)明涉及血管炎抗體檢測，具體為一種血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒。

背景技術(shù)：

1、系統(tǒng)性血管炎(systemic?vasculitis)是一組以血管的炎癥與壞死為主要病理改變的炎性疾病常累及全身多個(gè)系統(tǒng)，引起臟器功能障礙，累及的部位包括皮膚、腎臟、肺、神經(jīng)系統(tǒng)等。系統(tǒng)性血管炎主要分為原發(fā)性血管炎和繼發(fā)性血管炎。其中原發(fā)性血管炎指無明確病因者，分為大、中、小血管炎；繼發(fā)性血管炎指有明確病因者，如感染性疾病，自身免疫性疾病的sle和rf及藥物引起的血管炎等。系統(tǒng)性血管炎的相關(guān)抗體主要為抗中性粒細(xì)胞漿抗體(anca)，目前發(fā)現(xiàn)的主要抗原成分有蛋白酶3(pr3)、髓過氧化物酶(mpo)、組蛋白酶(cg)、乳鐵蛋白(lf)、殺菌/通透性增加蛋白(bip)、人白細(xì)胞彈力蛋白酶(hle)、溶酶體膜糖蛋白、α-烯醇化酶等，研究較清楚的是pr3和mpo。pr3是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種絲氨酸蛋白酶，分子量約為29kd，帶正電荷，可通過電荷作用種植于腎小球基底膜；還能抑制溶酶體酶。pr3-anca與pr3結(jié)合后，一方面可在腎臟局部形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體，引起組織損傷；另一方面溶酶體酶脫抑制，各種酶對(duì)細(xì)胞本身廣泛溶解引起嚴(yán)重而持久的損傷。后者是pr3-anca致病的主要原因，這也可部分解釋為什么pr3-anca陽性的疾病往往是多器官、多系統(tǒng)損害，病情較重，如韋哥內(nèi)氏肉芽腫((wg)病人，約56％是pr3-anca陽性，其特異性可達(dá)96％，往往侵犯上下呼吸道、肺、腎、皮膚、關(guān)節(jié)、肌肉、眼等。pr3較多表現(xiàn)于新生分葉核中性粒細(xì)胞(pmns)，故感染可誘發(fā)wg復(fù)發(fā)。

2、mpo亦是中性粒細(xì)胞顆?？乖煞种唬肿恿繛楸?50kd，帶正電荷，可種植在腎小球基膜上。mpo是中性粒細(xì)胞(pmns)激活過程中的重要的負(fù)反饋抑制酶，可滅活mpns趨化因子和抑制羥自由基的形成，因此，當(dāng)mpo-anca與mpo結(jié)合后，mpo功能受到抑制，pmns大量活化，呼吸爆發(fā)，脫顆粒，產(chǎn)生大量的活性氧粒子造成局部組織損傷。mpo-anca主要見于顯微鏡下多血管炎(mpa)、壞死性新月體腎炎(ncgn)，約有90％的ncgn病人mpo-anca陽性。

3、抗腎小球基底膜抗體是血清中會(huì)“攻擊”基底膜的一種抗體，抗gbm抗體陽性病人占自身免疫性腎炎的5％，在腎小球性腎炎、抗gbm抗體相關(guān)疾病中有80％的陽性檢出率，半月體形成性腎小球腎炎患者中有20％～70％的陽性檢出率，也可在增殖性腎炎中檢出。

4、基于此，pr3、mpo、gbm三項(xiàng)作為診斷血管炎的特異性抗體具體重要意義。

5、引發(fā)血管炎疾病的有多種標(biāo)志物抗體，單項(xiàng)檢測已不能滿足臨床需求，如不能做到一管血同時(shí)檢測多個(gè)自身抗體指標(biāo)，存在檢測效率低下和成本過高的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，用于解決現(xiàn)有技術(shù)檢測試劑盒成本高且檢測效率低下的缺陷。

2、有鑒于此，本發(fā)明的方案為：

3、一種血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，包括檢測膜條、封閉液、酶聯(lián)物、底物液、終止液及濃縮洗滌液；所述檢測膜條由載片及固定在載片上且包被有三條平行抗原檢測線組成，所述抗原檢測線由天然抗原彼此獨(dú)立的劃線在載體膜上并包被形成；所述天然抗原為pr3、mpo和gbm；所述抗原gbm為iv型膠原α-3鏈，采用丙酮法從牛腎中分離純化得到。

4、進(jìn)一步地，所述血管炎為自身免疫性血管炎，包括系統(tǒng)性血管炎、韋格內(nèi)氏肉芽腫、顯微鏡下多血管炎、壞死性新月體腎炎、腎小球性腎炎。

5、進(jìn)一步地，所述抗原pr3、mpo從人中性粒細(xì)胞中分離純化得到。

6、進(jìn)一步地，所述載體膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。

7、進(jìn)一步地，所述檢測膜條上還設(shè)有弱陽性質(zhì)控線、陽性質(zhì)控線。

8、進(jìn)一步地，所述酶聯(lián)物包括抗人igg-6#-hrp及hrp偶聯(lián)物穩(wěn)定/稀釋劑，比例為1：10000。

9、進(jìn)一步地，所述封閉液包括氯化鈉8.0g/l、氯化鉀0.2g/l、磷酸氫二鈉1.42g/l、聚乙二醇80005.0g/l、牛血清白蛋白5.0g/l及防腐劑。

10、進(jìn)一步地，所述底物液為1.2mmol四甲基聯(lián)苯胺；和/或，所述終止液為0.1mol/l硫酸。

11、進(jìn)一步地，所述濃縮洗滌液包括氯化鈉36.72g/l、氯化鉀3.73g/l、吐溫-2018.3ml/l、防腐劑20.0ml/l、濃鹽酸7.8ml/l及防腐劑。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益效果：

13、本發(fā)明提供的試劑盒可同時(shí)檢測3項(xiàng)自身抗體，降低檢測成本，同時(shí)具備抗干擾和抗交叉反應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，特異性好，靈敏度高，可適用于手工或儀器自動(dòng)化檢測應(yīng)用場景。

14、本發(fā)明提供的試劑盒通過調(diào)整免疫印跡法中的具備高親和力的二抗hrp(辣根過氧化物酶)濃度，增強(qiáng)二抗結(jié)合信號(hào)，可減少固相載體上包被的pr3、mpo和gbm的濃度，同時(shí)通過多步清洗解決高濃度抗體樣本hook效應(yīng)，提高的診斷的準(zhǔn)確性。

15、本發(fā)明提供的試劑盒所用抗原從動(dòng)物組織中或人細(xì)胞中進(jìn)行提取，將它們進(jìn)行純化分離后，包被與硝酸纖維素膜的載體上，彌補(bǔ)了免疫印跡診斷方法所用抗原不具有天然結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)，提高了自身免疫疾病診斷的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性。

16、本發(fā)明提供的試劑盒配套的復(fù)合質(zhì)控血清可作為臨床診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參照，更好地提高臨床診斷的正確性。

技術(shù)特征：

1.一種血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，包括檢測膜條、封閉液、酶聯(lián)物、底物液、終止液及濃縮洗滌液；所述檢測膜條由載片及固定在載片上且包被有三條平行抗原檢測線組成，所述抗原檢測線由天然抗原彼此獨(dú)立的劃線在載體膜上并包被形成；所述天然抗原為pr3、mpo和gbm；所述抗原gbm為iv型膠原α-3鏈，采用丙酮法從牛腎中分離純化得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述血管炎為自身免疫性血管炎，包括系統(tǒng)性血管炎、韋格內(nèi)氏肉芽腫、顯微鏡下多血管炎、壞死性新月體腎炎、腎小球性腎炎。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述抗原pr3、mpo從人中性粒細(xì)胞中分離純化得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述載體膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述檢測膜條上還設(shè)有弱陽性質(zhì)控線、陽性質(zhì)控線。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)物包括抗人igg-6#-hrp及hrp偶聯(lián)物穩(wěn)定/稀釋劑，比例為1：10000。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述封閉液包括氯化鈉8.0g/l、氯化鉀0.2g/l、磷酸氫二鈉1.42g/l、聚乙二醇8000?5.0g/l、牛血清白蛋白5.0g/l及防腐劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述底物液為1.2mmol四甲基聯(lián)苯胺；和/或，所述終止液為0.1mol/l硫酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液包括氯化鈉36.72g/l、氯化鉀3.73g/l、吐溫-20?18.3ml/l、防腐劑20.0ml/l、濃鹽酸7.8ml/l及防腐劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種血管炎抗體聯(lián)檢試劑盒，所述試劑盒包括檢測膜條、酶聯(lián)物、底物液、終止液及濃縮洗滌液；所述檢測膜條包被有天然抗原PR3、MPO和GBM組成的平行檢測線，該試劑盒可同時(shí)檢測3項(xiàng)自身抗體，具備抗干擾和抗交叉反應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，特異性好，靈敏度高，可適用于手工或儀器自動(dòng)化檢測應(yīng)用場景。

技術(shù)研發(fā)人員：魯翌,謝先洲,劉介,田樹偉,袁慎亮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢塞力斯生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/20