本發(fā)明涉及分子生物學，特別是涉及一種基于共聚焦熒光成像的8:2氟調聚醇-靶標蛋白的相互作用分析方法。

背景技術：

1、直鏈烷烴污染物8:2氟調聚醇(8:2ftoh)是一種能夠在食物鏈中富集的新型持久性有機污染物，廣泛應用于油漆、拋光劑、涂料、粘合劑和電子產品等商業(yè)和工業(yè)產品。8:2ftoh的廣泛應用，使其在環(huán)境中無處不在。而8:2ftoh又能通過空氣、土壤和食物等多種途徑進入動物和人體，并具有肝毒性、腎毒性、發(fā)育毒性、免疫毒性和內分泌干擾的風險。雖然8:2ftoh在環(huán)境中的水平及其引起的健康風險令人擔憂，但目前為止關于8:2ftoh誘導的組織損傷和炎癥機制研究較少。

2、芳烴受體(ahr)是一種高度保守的配體激活轉錄因子，是參與多種環(huán)境反應的中心傳感器，也是環(huán)境污染物誘導生物毒性的重要參與者。近年來，有研究報告說，pfas能夠激活ahr并通過該蛋白介導氧化應激和炎癥。但報道的研究中僅通過虛擬對接技術闡述pfas能夠與ahr結合并引起ahr通路相關基因cyp1a1表達的增加。已報道的ahr配體均為芳香平面烴，現(xiàn)階段尚沒有研究證實8:2ftoh是ahr的直接配體。

3、目前小分子和蛋白之間相互作用分析主要依賴于以下四種技術：熒光偏振免疫分析法(fluorescence?polarization?immunoassay，fpia)、等溫量熱滴定儀(itc)和表面離子體共振技術(spr)等技術。但這些方法存在儀器設備和試劑昂貴、操作復雜、蛋白獲取困難、蛋白固定困難和非特異性結合等缺點。fitc熒光成像觀察，具備所需試驗條件簡單，不需要附加的儀器設備，操作簡便等特點。但目前還未有fitc熒光成像測定8:2ftoh和ahr相互作用的分析報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于共聚焦熒光成像的8:2氟調聚醇-靶標蛋白的相互作用分析方法，以解決上述現(xiàn)有技術存在的問題。本發(fā)明利用fmoc-glu(otbu)oh為linker試劑與直鏈烷烴污染物8:2ftoh，產生具有較強熒光的8:2ftoh-glu(otbu)-fitc復合物，然后通過共聚焦顯微鏡觀察和分析8:2ftoh和靶標蛋白之間的相互作用強弱。本發(fā)明簡單直觀，經(jīng)濟適用性高，操作簡便；與以往的分子-蛋白互作技術相比較，試驗條件簡單，不需要附加的儀器設備。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供了一種基于共聚焦熒光成像的8:2氟調聚醇-靶標蛋白的相互作用分析方法，包括以下步驟：

4、8:2ftoh、fmoc-glu(otbu)oh和催化劑混合反應后，依次進行洗滌、無水硫酸鎂干燥和第一真空干燥，得到8:2ftoh-fmoc-glu(otbu)；

5、將所述8:2ftoh-fmoc-glu(otbu)去除fmoc基團，進行第二真空干燥，加入熒光素進行熒光反應，并進行純化，得到8:2ftoh-glu(otbu)-fitc；

6、將所述8:2ftoh-glu(otbu)-fitc和細胞進行共孵育，通過熒光定位分析確定化合物與靶標蛋白的相互作用。

7、優(yōu)選的，所述靶標蛋白為芳烴受體。

8、優(yōu)選的，所述8:2ftoh、fmoc-glu(otbu)oh和催化劑的摩爾濃度比為1:1.2:1。

9、優(yōu)選的，所述混合反應的時間為22h，溫度為20℃。

10、優(yōu)選的，所述去除fmoc基團采用的制劑為50％聚乙烯吡咯烷酮。

11、優(yōu)選的，所述催化劑為4-二甲氨基吡啶。

12、優(yōu)選的，所述熒光素為異硫氰酸。

13、優(yōu)選的，所述純化采用的純化柱為g25快速脫鹽柱。

14、優(yōu)選的，所述第一真空干燥的溫度為60℃，時間為0.5h；

15、和/或，所述第二真空干燥的溫度為60℃，時間為2h。

16、優(yōu)選的，所述熒光反應的溫度為4℃，時間為4h。

17、本發(fā)明公開了以下技術效果：

18、本發(fā)明基于共聚焦熒光成像建立了觀察和分析細胞中8:2ftoh和芳烴受體相互作用的方法，方法簡單直觀，經(jīng)濟適用性高，具體的：本發(fā)明利用fmoc-glu(otbu)oh為linker試劑與直鏈烷烴污染物8:2ftoh，產生具有較強綠色熒光的8:2ftoh-glu(otbu)-fitc復合物，然后通過共聚焦顯微鏡能夠觀察和分析8:2ftoh和靶標蛋白(ahr)之間的相互作用強弱。本發(fā)明簡單直觀，經(jīng)濟適用性高，操作簡便；與以往的分子-蛋白互作技術相比較，試驗條件簡單，不需要附加的儀器設備。

19、同時，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并報道了直鏈烷烴污染物8:2ftoh是ahr的直接配體，因此，本發(fā)明提供的相互作用分析方法能夠用于8:2ftoh通過激活ahr介導多器官炎癥和損傷的分析中。

技術特征：

1.一種基于共聚焦熒光成像的8:2氟調聚醇-靶標蛋白的相互作用分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述靶標蛋白為芳烴受體。

3.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述8:2ftoh、fmoc-glu(otbu)oh和催化劑的摩爾濃度比為1:1.2:1。

4.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述混合反應的時間為22h，溫度為20℃。

5.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述去除fmoc基團采用的制劑為50％聚乙烯吡咯烷酮。

6.根據(jù)權利要求1或3所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述催化劑為4-二甲氨基吡啶。

7.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述熒光素為異硫氰酸。

8.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述純化采用的純化柱為g25快速脫鹽柱。

9.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述第一真空干燥的溫度為60℃，時間為0.5h；

10.根據(jù)權利要求1所述的相互作用分析方法，其特征在于，所述熒光反應的溫度為4℃，時間為4h。

技術總結
本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，特別是涉及一種基于共聚焦熒光成像的8:2氟調聚醇?靶標蛋白的相互作用分析方法。本發(fā)明利用Fmoc?Glu(OtBu)OH為linker試劑與直鏈烷烴污染物8:2FTOH，產生具有較強綠色熒光的8:2FTOH?Glu(OtBu)?FITC復合物，然后通過共聚焦顯微鏡觀察和分析8:2FTOH和靶標蛋白(AHR)之間的相互作用強弱。本發(fā)明簡單直觀，經(jīng)濟適用性高，操作簡便；與以往的分子?蛋白互作技術相比較，試驗條件簡單，不需要附加的儀器設備。同時，本發(fā)明提供的相互作用分析方法能夠用于8:2FTOH通過激活AHR介導多器官炎癥和損傷的分析中。

技術研發(fā)人員：陳冬梅,謝書宇,陳敏
受保護的技術使用者：華中農業(yè)大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/8