本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及一種全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

1、who、fda和歐盟等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)以及各國(guó)藥典對(duì)生物制品中核酸殘留量有嚴(yán)格規(guī)定。全能核酸酶(如biolonase、benzonase等)作為核酸內(nèi)切酶，被廣泛用于生物制品(如重組蛋白、疫苗等)中核酸的去除。然而，在處理過(guò)程中可能會(huì)有核酸酶殘留，這會(huì)對(duì)生物制品的后續(xù)應(yīng)用造成影響。

2、已有相關(guān)專(zhuān)利：①江蘇譜新生物：一種benzonase核酸酶elisa檢測(cè)試劑盒及其使用方法。②上海翌圣生物：全能核酸酶benzonase核酸酶elisa檢測(cè)試劑盒。

3、現(xiàn)有技術(shù)中，已有以生物素與親和素系統(tǒng)為標(biāo)記物的elisa法，該方法利用生物素標(biāo)記抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素，由于生物素與鏈霉親和素的結(jié)合力非常強(qiáng)，能顯著減少背景干擾，提高方法的特異性和敏感性。然而，國(guó)內(nèi)大多數(shù)生物制品廠家主要使用merck的benonase?elisa?iii檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)范圍為0.031-2ng/ml，檢測(cè)靈敏度為0.1ng/ml，存在檢測(cè)靈敏度不高，背景偏高的問(wèn)題。

4、目前，缺乏一種高靈敏度的全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏度的全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒。

2、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒。

4、第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N試劑盒進(jìn)行全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)的使用方法。

5、第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體的制備方法。

6、本申請(qǐng)第一方面提供的一種全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒，全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒包括鼠單克隆抗體包被的酶標(biāo)板；生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體；鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶ap；biolonase核酸酶標(biāo)準(zhǔn)品；顯色液，其中包含amppd底物；樣品稀釋液和洗滌液。amppd(3-(4-甲氧基-4-甲基-1,3-二氧環(huán)戊烷-2-基)苯甲酸二鈉)是一種常用的化學(xué)發(fā)光底物，廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)和其他生物檢測(cè)方法中。

7、進(jìn)一步地，試劑盒用于定性和定量檢測(cè)biolonase核酸酶蛋白的含量，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01ng/ml。

8、進(jìn)一步地，鼠單克隆抗體包被的酶標(biāo)板預(yù)先包被了針對(duì)biolonase核酸酶蛋白的特異性單克隆抗體。

9、更進(jìn)一步地，生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體用于與biolonase核酸酶蛋白形成抗體-抗原復(fù)合物ag-ab。

10、進(jìn)一步地，鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶ap與生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體形成生物素-鏈霉親和素-ap復(fù)合物。

11、進(jìn)一步地，顯色液用于在堿性磷酸酶ap催化下分解amppd底物發(fā)光。

12、試劑盒適用于biolonase、benzonase等來(lái)源于serratia?marcescens的核酸酶檢測(cè)。

13、本申請(qǐng)第二方面提供的一種試劑盒進(jìn)行全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)的使用方法，包括如下步驟：

14、(1)酶標(biāo)板包被鼠單克隆抗體；

15、(2)加入含有biolonase核酸酶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品；

16、(3)加入生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體；

17、(4)加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶ap；所述鏈霉親和素標(biāo)記堿性磷酸酶為專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?02410020860.5中的基因重組鏈霉親和素與堿性磷酸酶的融合蛋白。

18、(5)加入amppd底物；

19、(6)測(cè)量發(fā)光值，并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算出待測(cè)樣品中biolonase核酸酶蛋白的含量。

20、進(jìn)一步地，測(cè)量發(fā)光值的步驟中，樣本發(fā)光值與其所含biolonase核酸酶蛋白含量呈正相關(guān)。

21、進(jìn)一步地，檢測(cè)靈敏度為0.01ng/ml。

22、本申請(qǐng)第三方面提供的一種生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

23、將兔多克隆抗體溶于pbs中，制備成1-3mg/ml的溶液；

24、在dmso中制備10mm的生物素試劑溶液；

25、將抗體溶液與生物素試劑溶液混合，室溫下攪拌孵育2-4小時(shí)；

26、加入nh4cl溶液，室溫下攪拌10分鐘；

27、對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析，去除未標(biāo)記的過(guò)量生物素試劑。

28、有益效果：本發(fā)明提供了一種高特異性，高靈敏度，低檢測(cè)限的核酸酶的檢測(cè)試劑盒，能夠有效檢出微量核酸酶殘留樣品，對(duì)于提高生物制品的安全性和質(zhì)量控制具有重要意義。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)高特異性和靈敏度：本發(fā)明采用特異性高的單克隆抗體原料，利用生物素與鏈霉親和素之間極高的親和力及信號(hào)放大作用，提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。

30、(2)低檢測(cè)背景：本發(fā)明采用靈敏更高的化學(xué)發(fā)光底物代替普通顯色底物，從而制備出靈敏度高、背景低的核酸酶化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒。低檢測(cè)限：本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01ng/ml，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)的0.1ng/ml，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度。

31、(3)信號(hào)放大作用：使用生物素標(biāo)記的二抗為檢測(cè)抗體，生物素為小分子標(biāo)記物，抗體與標(biāo)記物具有更高的摩爾比，有更大的信號(hào)放大倍數(shù)。極低的背景特性：生物素與親和素具有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此具有更低背景的特性。

32、(4)保持天然活性：采用基因工程表達(dá)的鏈霉親和素-堿性磷酸酶，相比采用化學(xué)標(biāo)記的方法，親和素及堿性磷酸酶都保持了天然的活性，避免在化學(xué)標(biāo)記過(guò)程中造成的活性損失。高靈敏度檢測(cè)：采用化學(xué)發(fā)光底物作為顯色方法，檢測(cè)靈敏度較常規(guī)的tmb顯色法大幅度提高。

技術(shù)特征：

1.一種全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒，其特征在于：全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)試劑盒包括鼠單克隆抗體包被的酶標(biāo)板；生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體；鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶ap；biolonase核酸酶標(biāo)準(zhǔn)品；顯色液，其中包含amppd底物；樣品稀釋液和洗滌液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒用于定性和定量檢測(cè)biolonase核酸酶蛋白的含量，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01ng/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述鼠單克隆抗體包被的酶標(biāo)板預(yù)先包被了針對(duì)biolonase核酸酶蛋白的特異性單克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體用于與biolonase核酸酶蛋白形成抗體-抗原復(fù)合物ag-ab。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶ap與生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體形成生物素-鏈霉親和素-ap復(fù)合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述顯色液用于在堿性磷酸酶ap催化下分解amppd底物發(fā)光。

7.一種權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析cleia檢測(cè)的使用方法，其特征在于包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：在步驟(6)中，所述測(cè)量發(fā)光值的步驟中，樣本發(fā)光值與其所含biolonase核酸酶蛋白含量呈正相關(guān)。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：在步驟(6)中，檢測(cè)靈敏度為0.01ng/ml。

10.一種生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種全能核酸酶殘留化學(xué)發(fā)光免疫分析CLEIA檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)生物制品中殘留的全能核酸酶。該試劑盒通過(guò)雙抗體夾心法實(shí)現(xiàn)高靈敏度和低檢測(cè)限的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01ng/ml。試劑盒包括鼠單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶AP、Biolonase核酸酶標(biāo)準(zhǔn)品、顯色液、樣品稀釋液和洗滌液。本發(fā)明還提供了制備生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體的方法，以及使用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟。該試劑盒在生物制品的質(zhì)量控制和安全性評(píng)估中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

技術(shù)研發(fā)人員：汪寄宇,向梅,楊洋,陳丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海拜朗生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8