專利名稱：血液白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定血液樣品中白細(xì)胞和血紅蛋白濃度的試劑。
血液中白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度的測定對(duì)于白血病和貧血癥等的臨床診斷以及治療過程的監(jiān)測來說至關(guān)重要。
現(xiàn)在，白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度可以用自動(dòng)血液分析裝置在很短時(shí)間內(nèi)測出，其應(yīng)用非常廣泛。
自動(dòng)血液分析裝置大致可以區(qū)分為按檢測光散射和熒光等的光學(xué)檢測方式工作的和按檢測粒子通過細(xì)孔時(shí)的阻抗變化的電阻檢測方式工作的，但后者從簡便程度上看則更優(yōu)。應(yīng)用電阻檢測方式時(shí)，白細(xì)胞數(shù)的測定是往血液樣品中加入溶血?jiǎng)┤芙饧t細(xì)胞，得到只剩下白細(xì)胞的測定用樣品后，讓其通過檢測器，檢測所發(fā)生的信號(hào)而進(jìn)行測定。
此外，通常外周血液中的白細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等五種，將溶血?jiǎng)┑慕M成進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐浔炔⑦M(jìn)行2至3次的分級(jí)分離，就能只檢測特定種類的白細(xì)胞。象這樣，就能使不得不依靠顯微鏡進(jìn)行的白細(xì)胞分類自動(dòng)地在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，從而減輕了檢查人員的負(fù)擔(dān)，而且不需要特別的技術(shù)。
另一方面，對(duì)于血紅蛋白濃度的測定則采用以含氰化物的VanKampen試劑將血紅蛋白轉(zhuǎn)化成氰化高鐵血紅蛋白在541納米附近測定吸光度的方法作為國際標(biāo)準(zhǔn)方法。此外，在用自動(dòng)血細(xì)胞分析裝置時(shí)，用具表面活性作用的季銨鹽一邊將紅細(xì)胞碎片化一邊使血紅蛋白變性，用氰化堿得到氰化高鐵血紅蛋白樣的吸收曲線從而進(jìn)行測定，還可以對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行測定。但是在這些方法中，由于試劑中含有有害的氰化物，其試劑和測定后的樣品必須進(jìn)行無毒化才能廢棄。
因此，已知有在測定血紅蛋白濃度時(shí)不用氰化物且能夠進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑(美國專利第4,185,964號(hào))。此試劑中含有能夠完全阻止白細(xì)胞溶解量的具表面活性作用的水溶性季銨鹽和少量碳數(shù)至8個(gè)的多羧酸。更進(jìn)一步，還已知有能使白細(xì)胞分成三類的溶血?jiǎng)?。這其中含有季銨鹽和特殊的血紅蛋白穩(wěn)定化劑。(特開平3-137566號(hào)、特開平3-252557號(hào)、特開平4-13969號(hào))上述的溶血?jiǎng)┠苁寡t蛋白快速變性，但是具有如果樣品液溫變化時(shí)則血紅蛋白濃度發(fā)生巨大變化的缺點(diǎn)。特別是在美國專利第4185964號(hào)中，因?yàn)闆]有穩(wěn)定化劑，變化很大。在特開平3-137566號(hào)、特開平3-252557號(hào)、特開平4-13969號(hào)中，因加入特殊的血紅蛋白穩(wěn)定化劑所以變化變小，但是液溫變化時(shí)血紅蛋白濃度仍發(fā)生變化，在這種情況下穩(wěn)定化效果不充分。因此為了得到穩(wěn)定的測定值，就必須有使液溫保持恒定的裝置。這是使整個(gè)裝置成本提高的主要因素之一。
本發(fā)明的目的在于提供不用氰化物的、能夠測定白細(xì)胞數(shù)的、以及樣品液溫變化的也能穩(wěn)定地測定血紅蛋白濃度的試劑。
本發(fā)明的白細(xì)胞及血紅蛋白濃度測定試劑含有(1)能夠溶解紅細(xì)胞、使血紅蛋白變性的量的陽離子表面活性劑，(2)選自下述(a)、(b)和(c)中至少1種的血紅蛋白穩(wěn)定化劑(a)能促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的磺基水楊酸或其鹽。
(b)0.2至10.0克/升的含氮原子和羧基的水溶性螯合劑。
(c)能促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的哌嗪或其鹽。
(3)維持pH為4-6的緩沖劑。
用本發(fā)明的白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑，能同時(shí)測定白細(xì)胞和血紅蛋白濃度，也能進(jìn)行別的測定。
本發(fā)明的白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑中，含有能使紅細(xì)胞溶解、血紅蛋白變化的量的陽離子型表面活性劑。作為陽離子型表面活性劑，至少含有具下述結(jié)構(gòu)的季銨鹽型或吡啶鎓鹽型中的一種。
具體的優(yōu)選下述的物質(zhì)(a)季銨鹽[化1]
(式中R1為C8-C20的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4分別為C1-C8的烷基、鏈烯基或炔基，X為鹵素離子)(b)吡啶鎓鹽[化2]
(式中n為7-19的整數(shù)，X為鹵素離子)本發(fā)明試劑使用的陽離子表面活性劑的合適濃度為0.1-15.0克/升。上述的表面活性劑優(yōu)選季銨鹽，濃度優(yōu)選0.1-4.0克/升。此外，將上述的表面活性劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕M合，可以將白細(xì)胞分成例如淋巴細(xì)胞和其它細(xì)胞的兩類或淋巴細(xì)胞、中性性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞三類。
此外，在本發(fā)明的白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑中，含有能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的血紅蛋白穩(wěn)定化劑。穩(wěn)定化劑選自(a)磺基水楊酸或其鹽、(b)具氮原子和羧基的水溶性螯合劑以及(c)哌嗪或其鹽中至少1種。作為水溶性螯合劑，例如有乙二胺四乙酸或其鹽、二氨基丙醇四乙酸或其鹽、二氨基丙烷四乙酸或其鹽、乙二胺二乙酸或其鹽、乙二胺二丙酸或其鹽等。特別優(yōu)選的為乙二胺四乙酸鹽。
血紅蛋白穩(wěn)定化劑的用量為促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量，通常在0.2-10.0克/升的范圍比較合適。至于更合適的濃度因所用物質(zhì)不同而不同，在使用磺基水楊酸或其鹽的場合，更合適的濃度為0.2-2.0克/升。此外，在使用水溶性螯合劑的時(shí)候的特別合適的濃度，例如用乙二胺四乙酸鹽時(shí)為0.5-10克/升，用二氨基丙醇四乙酸或其鹽時(shí)為0.5-5克/升，用二氨基丙烷四乙酸或其鹽時(shí)為0.5-5克/升，用乙二胺二乙酸或其鹽時(shí)為0.5-5克/升，用乙二胺二丙酸二鹽酸鹽時(shí)為0.5-5克/升。用哌嗪或其鹽時(shí)，合適的為0.5-5克/升。另外，這些穩(wěn)定化劑有緩沖能力的時(shí)候，也可作為緩沖劑的一部分而使用。
可以推測，這些穩(wěn)定化劑可與由上述的陽離性表面活性劑或其組合物引起變性的高鐵血紅蛋白中的血紅素鐵結(jié)合，從而起到穩(wěn)定化的作用。
緩沖劑為能維持pH在4.0-6.0的物質(zhì)，沒有特殊的限定。pH如果太低的話，白細(xì)胞會(huì)脆弱化從而對(duì)白細(xì)胞數(shù)的測定產(chǎn)生不良的影響。而且如果pH太高則血紅蛋白的歷時(shí)穩(wěn)定性變差。具體的說可以用眾所周知的Good緩沖劑、磷酸緩沖劑、琥珀酸緩沖劑、馬來酸-Tris緩沖劑等。其濃度為5-50mM，更合適的是15-30mM。
還有，上述各成分的濃度為將血液直接用本發(fā)明的白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑稀釋使用時(shí)的濃度。此外血液先用稀釋液(例如生理鹽水或CELLPACKTM(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社))稀釋后再加試劑也可以。在這種情況下，為了使試劑添加后的濃度在上述范圍內(nèi)，可以對(duì)各成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。這時(shí)所用的稀釋液，為了保持血細(xì)胞的形態(tài)通常應(yīng)該使用pH在中性附近(6-8)、滲透壓在等張附近(240-330Osm/kg的)。
本發(fā)明的試劑的電導(dǎo)優(yōu)選作成8-20mS/cm，更優(yōu)選10-15mS/cm。電導(dǎo)的調(diào)節(jié)可以適當(dāng)加入氯化鈉等電解質(zhì)而進(jìn)行。
用本發(fā)明的白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑調(diào)制血液樣品，將此樣品導(dǎo)入自動(dòng)血細(xì)胞分析裝置，用同一樣品可以同時(shí)或分別測定根據(jù)檢測粒子通過細(xì)孔時(shí)阻抗變化而得的白細(xì)胞數(shù)、或者根據(jù)檢測樣品吸光度而得的血紅蛋白濃度。
作為本發(fā)明試劑的組成例例如有以下所舉的。
組成例1氯化十六烷基三甲基銨0.3-3.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升磷酸緩沖液 15-30mM氯化鈉 適量精制水 1升組成例2氯化月桂基三甲基銨 0.3-10.0克/升氯化硬脂?；谆@0.1-1.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升Good緩沖液 15-30mM氯化鈉 適量精制水 1升組成例3氯化月桂基三甲基銨 0.3-10.0克/升月桂基二甲基銨乙內(nèi)酯0.5-5.0克/升EDTA-2K 0.5-5.0克/升琥珀酸緩沖液15-30mM氯化鈉 適量精制水 1升用組成例1-3可以同時(shí)測定白細(xì)胞和血紅蛋白，但調(diào)整各表面活性劑的種類和濃度則能夠?qū)准?xì)胞分成2個(gè)以上的集團(tuán)。白細(xì)胞的集團(tuán)表示例如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等。組成例1為將白細(xì)胞分成1個(gè)集團(tuán)的組合物，組成例2、3為將白細(xì)胞分別分成2-3個(gè)集團(tuán)的組合物。實(shí)施例1對(duì)溫度變化的穩(wěn)定性按以下配方調(diào)制本發(fā)明的試劑和比較例1、2的試劑，測定在不同溫度下反應(yīng)的血紅蛋白量。本發(fā)明的試劑氯化月桂基三甲基銨 3.0克/升氯化硬脂酰基三甲基銨 0.2克/升EDTA-2K 1.0克/升磷酸緩沖液 20mM(pH5.0)氯化鈉 適量(使電導(dǎo)為約13mS/cm的量)精制水 1升比較例1氯化月桂基三甲基銨 3.0克/升氯化硬脂?；谆@0.2克/升磷酸緩沖液 20mM氯化鈉 適量(使電導(dǎo)為約13mS/cm的量)精制水 1升比較例2氯化月桂基三甲基銨 3.0克/升氯化硬脂?；谆@0.2克/升咪唑1.0克/升Tris-馬來酸緩沖液 (使電導(dǎo)為約13mS/cm的量)精制水 1升將血液用上述組成的各試劑稀釋至500倍，在10℃和35℃下反應(yīng)30秒后用分光光度計(jì)測定吸光度，算出35℃下的吸光度對(duì)應(yīng)10℃下吸光度的變化率，并由此求出變化的血紅蛋白量(換算值)。所得結(jié)果如表1所示。
表1試劑 變化率 血紅蛋白變化量(換算值)本發(fā)明-3.50％-0.53克/分升比較例1 -15.7％-2.34克/分升比較例2 -6.1％ -0.91克/分升變化率＝35℃下的吸光度/10℃下的吸光度比較例1的試劑為從本發(fā)明的試劑除去穩(wěn)定化劑后的組成，但是這種情況下對(duì)溫度的變化率很大。上述本發(fā)明的試劑中含有EDTA-2K作為穩(wěn)定化劑，比較例2中含有咪唑作為穩(wěn)定化劑，它們的變化率就比不含穩(wěn)定化劑的比較例1小。
作為穩(wěn)定化劑可以使用除此之外的物質(zhì)，但其變化率的程度因所用的穩(wěn)定化劑的種類不同而不同。
實(shí)施例2與現(xiàn)有方法的相關(guān)關(guān)系試劑組成氯化月桂基三甲基銨8.7克/升氯化硬脂?；谆@ 0.8克/升EDTA-2K 3.0克/升磷酸緩沖液60mM(pH5.0)氯化鈉使電導(dǎo)為13mS/cm的量精制水1升1)血紅蛋白的相關(guān)關(guān)系用上述試劑，以CELLPACKTM(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)為稀釋液，使用K-4500(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)，以113檢體進(jìn)行血紅蛋白量的測定。以氰化高鐵血紅蛋白變法(用自動(dòng)血細(xì)胞分析裝置對(duì)國際標(biāo)準(zhǔn)法作改良的方法使用STROMATOLYSER-C(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)，同樣地以K-4500測定)測定的血紅蛋白量為對(duì)照作出相關(guān)圖(

圖1)。用此裝置是，血液先用稀釋液稀釋，然后和上述試劑混合。最終血液被稀釋500倍，上述試劑的陽離子表面活性劑、EDTA-2K、磷酸緩沖液濃度變成三分之一。稀釋液中也含有氯化鈉，因此電導(dǎo)基本不變。圖中的X軸表示現(xiàn)有方法，Y軸表示用本發(fā)明試劑的方法。圖的相關(guān)系數(shù)r＝0.997，回歸直線Y＝0.951X+0.588，說明得到良好的相關(guān)關(guān)系，從而確認(rèn)血紅蛋白的測定可能。
2)白細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系用上述試劑，以CELLPACKTM(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)為稀釋液，使用K-4500(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)進(jìn)行白細(xì)胞數(shù)的測定。對(duì)照使用STROMATOTOLYSER-3WPTM(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)，同樣地以K-4500進(jìn)行測定，作成相關(guān)圖(圖2)(N＝113)。圖的相關(guān)系數(shù)r＝0.997，因歸直線Y＝0.986X+1.137，說明得到良好的相關(guān)關(guān)系，從而確認(rèn)和現(xiàn)有方法一樣能夠?qū)Π准?xì)胞進(jìn)行測定。
此外，就白細(xì)胞分類值進(jìn)行探討，得到和現(xiàn)有方法一樣的良好相關(guān)關(guān)系(N＝51)。結(jié)果如圖3-圖5所示。其中W-SCR相當(dāng)于添加溶血?jiǎng)┖笮⌒桶准?xì)胞比率的淋巴細(xì)胞比率，W-LCR相當(dāng)于添加溶血?jiǎng)┖蟠笮桶准?xì)胞比率的中性粒細(xì)胞比率，W-MCR相當(dāng)于添加溶血?jiǎng)┖笾行桶准?xì)胞比率的其它白細(xì)胞比率。此外，粒度分布圖如圖6所示。
實(shí)施例3白細(xì)胞成二分類的試劑試劑組成氯化月桂基三甲基銨 6.1克/升氯化硬脂酰基三甲基銨 1.1克/升EDTA-2K 3.0克/升磷酸緩沖液 60mM(pH5.0)氯化鈉 使電導(dǎo)為13mS/cm的量精制水 1升用上述試劑，以CELLPACKTM(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)作稀釋劑，使用K-4500(東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社)進(jìn)行白細(xì)胞的測定時(shí)，確證白細(xì)胞能被分成兩類。粒度分布圖如圖7所示。圖中較小的群相當(dāng)于淋巴細(xì)胞，較大的群相當(dāng)于其它的白細(xì)胞。
應(yīng)用本發(fā)明能夠在樣品液溫變化下穩(wěn)定地進(jìn)行白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度的測定。這樣就不需要使樣品液溫保持恒定的部件，從而能使分析裝置的成本變得便宜。
此外，因?yàn)椴挥们杌锞湍苓M(jìn)行白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度的測定，所以就不需要進(jìn)行廢液處理等特別的操作。[圖1]用本發(fā)明試劑的血紅蛋白量和現(xiàn)有方法測定的血紅蛋白量的相關(guān)圖。用本發(fā)明試劑測定的白細(xì)胞數(shù)和現(xiàn)有方法測定的白細(xì)胞數(shù)的相關(guān)圖。用實(shí)施例2試劑測定的W-SCR和現(xiàn)有方法測定的W-SCR的相關(guān)圖。用實(shí)施例2試劑測定的W-MCR和現(xiàn)有方法測定的W-MCR的相關(guān)圖。用實(shí)施例2試劑測定的W-LCR和現(xiàn)有方法測定的W-LCR的相關(guān)圖。用實(shí)施例2試劑測定的白細(xì)胞的粒度分布圖。用實(shí)施例3試劑測定的白細(xì)胞的粒度分布圖。
權(quán)利要求
1.白細(xì)胞和血紅蛋白濃度測定試劑，含有(1)能夠使紅細(xì)胞溶解、血紅蛋白變性的量的陽離子型表面活性劑；(2)選自下述(a)，(b)和(c)中至少1種的血紅蛋白穩(wěn)定化劑(a)促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的磺基水楊酸或其鹽(b)0.2-10.0克/升的具氮原子和羧基的水溶性螯合劑、(c)促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的哌嗪或其鹽；(3)維持pH在4-6的緩沖劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中水溶性螯合劑為EDTA鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量為0.2-10.0克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開了不用氰化物的能夠測定白細(xì)胞數(shù),而且樣品液溫變化時(shí)仍能穩(wěn)定進(jìn)行血紅蛋白濃度測定的試劑,含有(1)能夠使紅細(xì)胞溶解、血紅蛋白變性的量的陽離子型表面活性劑;(2)選自下述(a)、(b)和(c)中至少1種的血紅蛋白穩(wěn)定化劑:(a)促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的磺基水楊酸或其鹽、(b)0.2—10.0克/升的具氮原子和羧基的水溶性螯合劑、(c)促進(jìn)轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的有效量的哌嗪或其鹽;(3)維持pH在4—6的緩沖劑。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1197211SQ9810665
公開日1998年10月28日 申請(qǐng)日期1998年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月18日
發(fā)明者內(nèi)橋欣也, 池內(nèi)喜郎, 白上篤, 浜口行雄 申請(qǐng)人:東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社