一種三維重建觀察細胞在載體內(nèi)增殖分布的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及活體染料領域，更具體地，涉及一種長時間存留在細胞內(nèi)部用于觀察細胞在三維支架內(nèi)部分布及數(shù)量變化的活體染料的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界組織、器官及生物體細胞的基本形狀均是三維立體形狀。將細胞種植于載體內(nèi)進行三維培養(yǎng)，研宄細胞之間的相互影響、細胞對各種信號應激或者細胞與支架的聯(lián)系，已成為深入探索生命機制的重要方法和細胞研宄的必然趨勢。然而，諸如免疫組化、普通光鏡觀察等傳統(tǒng)的影像學技術(shù)不能對三維培養(yǎng)進行立體評估，如果破壞支架提取細胞后再檢測又將影響細胞功能狀態(tài)。所以運用影像學技術(shù)觀察三維狀態(tài)細胞非常重要。已經(jīng)相繼出現(xiàn)的有關技術(shù)，包括超聲成像、核磁共振成像(MagneticResonance Imaging, MRI)、X線成像和核素成像等。這些成像技術(shù)不但需要專業(yè)的人員操作，可能有放射性，價格昂貴，而且它們的分辨率低(>1μπι)，不能夠很好地觀察細胞在支架內(nèi)分布和生長。光學成像有效彌補了這一不足，它的分辨率相對較高(>0.1 μπι)，可以觀察細胞及其亞結(jié)構(gòu)，其中利用激光共聚焦顯微鏡對不同焦面掃描后重構(gòu)出三維立體圖形的成像技術(shù)容易實施，操作簡單，成本低，使用安全，是較理想的成像方法。為了使細胞在激光共聚焦顯微鏡下成像，就需要對細胞進行著色，使其易于分辨。我們采用活體染料羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyf luorescein diac-etate，succinimidyl ester, CFDA-SE，南京晶恩生物科技有限公司出產(chǎn))對細胞著色。自從Lonys首次將CFDA-SE作為活體染料檢測細胞以來，它被廣泛地用于分析多種細胞如淋巴細胞、腫瘤細胞、干細胞等存活。其工作原理為:非極性分子CFDA-SE可以自由透過細胞膜進入細胞，被細胞內(nèi)酯酶催化分解成羧基熒光素琥珀酰亞胺醋(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)，CFSE不可逆地與細胞內(nèi)蛋白結(jié)合并熒光標記細胞內(nèi)蛋白上，也不會被降解或者代謝，對細胞生理活動無明顯影響。成熟細胞的熒光標記均勻穩(wěn)定呈綠色，可持續(xù)兩個月以上。細胞分裂后，熒光蛋白可以平均分配到子細胞中，熒光強度減半。通常用流式細胞儀進行分析動力學參數(shù)如分裂率、死亡率、進入第I代分裂時間、平均細胞周期等。CFDA-SE染色法相對于傳統(tǒng)的測定細胞增殖染色法3H-TdR摻入法、MTT比色法優(yōu)勢明顯，細胞用量少，操作簡單，且可以分析單個細胞的增殖信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的任務是提供一種利用CFDA-SE染色觀測三維培養(yǎng)細胞的方法，即一種三維培養(yǎng)光學成像方法，具體是一種經(jīng)過CFDA-SE染色的細胞封裝在載體內(nèi)由激光共聚焦顯微鏡掃描后三維重建來觀察細胞在載體內(nèi)增殖、分布的方法。該方法簡單快捷，僅需10分鐘染色，價格便宜(相對熒光標記抗體)，可以連續(xù)觀察2個月以上。
[0004]按照本發(fā)明，提供一種三維重建觀察細胞在載體內(nèi)增殖分布的方法，該方法過程為:將用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5uM的終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌后將染色后的細胞封裝在載體內(nèi)構(gòu)建三維培養(yǎng)體系，在不同時間點對該三維培養(yǎng)體系不同層面行激光共聚焦掃描并三維重建，得到僅有綠色球形熒光的重建圖。
[0005]實現(xiàn)本發(fā)明的具體方案是:
[0006]本發(fā)明提供的三維重建觀察細胞在載體內(nèi)增殖分布的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一、細胞染色:用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5微摩爾每升(μΜ)的最終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌去除殘余的染色劑后得到著色目的細胞；
[0008]步驟二、構(gòu)建三維培養(yǎng)體系:將著色目的細胞封裝在載體(如水凝膠、蛋白質(zhì)、基質(zhì)等)內(nèi)構(gòu)建三維培養(yǎng)體系；
[0009]步驟三、激光共聚焦顯微鏡三維重建:在不同時間點對該三維培養(yǎng)體系不同層面行激光共聚焦顯微鏡掃描并進行三維重建，得到僅有綠色球形熒光的能直接觀察目的細胞在載體內(nèi)分布的重建圖。
[0010]步驟三中所述的三維重建是利用NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件進行的三維重建。
[0011 ] 步驟三所得到的重建圖可以是用CFDA-SE染色細胞得到的。步驟二所構(gòu)建的三維培養(yǎng)體系可以反復三維重建。
[0012]優(yōu)選地，在本發(fā)明中，重建后圖像分辨率在大于0.1 μ m，而且可以根據(jù)需要設定step (每層厚度)，分辨率會更高。按照本發(fā)明，經(jīng)過簡單操作和廉價的檢測就可以直觀觀察目的細胞在載體內(nèi)的分布與數(shù)量變化，彌補了普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡不能很好觀察三維培養(yǎng)的細胞的不足。
【附圖說明】
[0013]圖1.CFDA-SE工作原理示意圖CFDA-SE通透細胞膜進入細胞，可以被細胞內(nèi)的酯酶分解成CFSE，CFSE不可逆地和細胞內(nèi)蛋白的氨基發(fā)生結(jié)合反應，并標記這些蛋白，也不會被降解或代謝。
[0014]圖2.CFDA-SE染色法觀測三維培養(yǎng)細胞的流程圖
[0015]圖3.三維重建后效果圖可見長方體內(nèi)白色點狀即為細胞
【具體實施方式】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0017]實施例1
[0018]如圖2所示，我們分三步實施本發(fā)明方法:
[0019]第一步:細胞染色
[0020]我們選取目的細胞為生長狀態(tài)良好的第3代臍靜脈內(nèi)皮細胞，2.5%胰酶-0.02%EDTA液消化I分鐘，DMEM高糖培養(yǎng)基重懸中和胰酶，4°C下100rpm離心5分鐘，PBS重懸制作成濃度為2 X 16的細胞懸液；購自南京恩晶生物科技有限公司5mg的CFDA-SE，用二甲基亞砜溶解成lOmmol/1的儲存液，在_20°C冰箱中保存。臨用前，取適量儲存液用PBS稀釋為5 μ M工作液并平衡至室溫。將該工作液與臍靜脈細胞懸液等體積混勻，37°C避光孵育10分鐘，100rpm離心5分鐘后棄上清，PBS洗滌3次以去除殘余的染色劑，得到著色目的細胞；
[0021]第二步:構(gòu)建三維培養(yǎng)體系
[0022]我們采取對細胞無毒，溶脹性及降解性良好的載體，載體制作及包封細胞過程為:濃度為I X 14個/ μ I的著色目的細胞與載體等體積混合后，用100 μ I移液器取出30 μ I置入去頭端Iml注射器內(nèi)，緩慢鋪于注射器活塞平面上。然后置于37°C溫箱內(nèi)孵育lOmin，待載體呈固態(tài)，即構(gòu)建了三維培養(yǎng)體系，整個過程需要避光；
[0023]第三步:激光共聚焦顯微鏡三維重建
[0024]三維培養(yǎng)體系加入目的細胞培養(yǎng)基中溶脹lOmin，放入37°C溫箱中培養(yǎng)，I天后用激光共聚焦顯微鏡對其進行斷層掃描。利用NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件三維重建得到圖3效果，其中白色點狀結(jié)構(gòu)即為細胞。操作如下:
[0025]I)將三維培養(yǎng)體系取出置入直徑35mm的激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，不加入培養(yǎng)基;
[0026]2)設定激光光源488nm波長的綠光，設定綠色通道，點擊Acquire菜單下CaptureZ Series里Capture Automatically選項，即為Z軸序列拍攝，在目鏡下觀察確定需要掃面的頂面和底面并設定，同時設定step，開始掃描。掃描結(jié)束后點擊“Show Volume Viewer”進行三維重建；
[0027]3)關閉NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件和激光共聚焦顯微鏡，取出三維培養(yǎng)體積置入孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，便于日后對樣本重復掃描；
[0028]4)使用激光共聚焦顯微鏡時，室內(nèi)避光，遠離電磁輻射源，環(huán)境清潔，控制工作溫度在5?25°C。
[0029]利用CFDA-SE著色后激光共聚焦顯微鏡重建用于多種三維培養(yǎng)狀態(tài)的細胞和支架，但是具體染色時間、CFDA-SE濃度和細胞濃度需要自行摸索，以將CFDA-SE對細胞生命活性的影響降到最低。不同時間對同一位置進行掃描和三維重建，必須每次曝光度相同，并對其感興趣區(qū)域統(tǒng)計(ROI Statistics)，還能夠分析感興趣區(qū)域面積、平均光強、總光強、
信噪比等信息。
【主權(quán)項】
1.一種三維重建觀察細胞在載體內(nèi)增殖分布的方法，包括以下步驟: 步驟一、細胞染色:用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5微摩爾每升的最終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌去除殘余的染色劑后得到著色目的細胞； 步驟二、構(gòu)建三維培養(yǎng)體系:將著色目的細胞封裝在載體水凝膠、蛋白質(zhì)、基質(zhì)內(nèi)構(gòu)建三維培養(yǎng)體系； 步驟三、激光共聚焦顯微鏡三維重建:在不同時間點對該三維培養(yǎng)體系不同層面行激光共聚焦顯微鏡掃描并進行三維重建，得到僅有綠色球形熒光的能直接觀察目的細胞在載體內(nèi)分布的重建圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三中所述的三維重建是利用NISElements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件進行的三維重建。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟三所得到的重建圖的分辨率大于0.1微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三所得到的重建圖是用CFDA-SE染色細胞得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，步驟二所構(gòu)建的三維培養(yǎng)體系可以反復三維重建。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種三維重建觀察細胞在載體內(nèi)增殖分布的方法，該方法過程為：將用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5uM的終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37℃孵育6-15分鐘，洗滌后將染色后的細胞封裝在載體內(nèi)構(gòu)建三維培養(yǎng)體系，在不同時間點對該三維培養(yǎng)體系不同層面行激光共聚焦掃描并三維重建，得到僅有綠色球形熒光的重建圖。經(jīng)過CFDA-SE染色的細胞封裝在載體內(nèi)由激光共聚焦顯微鏡掃描后三維重建來觀察細胞在載體內(nèi)增殖、分布。該方法簡單快捷，僅需10分鐘染色，相對熒光標記抗體價格便宜，可以連續(xù)觀察2個月以上。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號】CN104697970
【申請?zhí)枴緾N201510114737
【發(fā)明人】張洪躍, 史嘉瑋, 趙磊, 董念國
【申請人】華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月17日