一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種酶電極傳感器的制備方法及快速檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法，用于檢測(cè)藥品、生物樣品中的S-腺苷甲硫氨酸技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]酶電極分析方法是將酶蛋白分子采用傳統(tǒng)的吸附法、包埋法、共價(jià)鍵合法、交聯(lián)法作用固定化制成固定化酶膜，再與電化學(xué)基礎(chǔ)電極相結(jié)合，構(gòu)成酶電極生物傳感器用于特異底物分析的一項(xiàng)生物技術(shù)。由于酶的高度專(zhuān)一性，該方法具有專(zhuān)一性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)速度快、選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)。酶電極研宄起步于20世紀(jì)60年代，自2000年以來(lái)，生物傳感器技術(shù)在環(huán)境檢測(cè)、食品安全、軍事和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用日益廣泛，在申請(qǐng)?zhí)枮?01410210210.3的專(zhuān)利中公開(kāi)了檢測(cè)對(duì)苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應(yīng)用；在授權(quán)公告號(hào)為CN102435650 B的專(zhuān)利中公開(kāi)了一種酶電極的制備及快速檢測(cè)植物油過(guò)氧化值的方法；在授權(quán)公告號(hào)為CN102495115 B的專(zhuān)利中公開(kāi)了利用生物酶電極法檢測(cè)根系分泌物中蘋(píng)果酸的電化學(xué)方法。
[0003]細(xì)胞內(nèi)的甲基化反應(yīng)存在通用甲基供體一S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosyImeth1nine，AdoMet，SAM)，SAM含有活性甲基，細(xì)胞內(nèi)幾乎所有用于甲基化修飾的甲基都來(lái)自SAM甲硫高能鍵。由于甲基化反應(yīng)的廣泛性，可以說(shuō)，SAM是細(xì)胞內(nèi)參加反應(yīng)的重要性?xún)H次于ATP的一種輔酶，細(xì)胞內(nèi)SAM濃度的微小改變，便會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能產(chǎn)生重大影響。SAM在細(xì)菌體內(nèi)主要是由SAM合成酶(MetK)通過(guò)甲硫氨酸(Met)和ATP來(lái)合成。當(dāng)E.的SAM合成酶水平下降，造成細(xì)胞內(nèi)甲基供體SAM缺乏時(shí)，細(xì)胞就不會(huì)正常分裂。如果將來(lái)自T3噬菌體的AdoMet水解酶基因?qū)隕.菌體細(xì)胞，使胞內(nèi)SAM水平下降時(shí)，大腸埃希氏菌也形成了不分裂的長(zhǎng)絲狀菌體。進(jìn)一步研宄表明，絲狀菌體中，引發(fā)疋細(xì)胞分裂的Z環(huán)復(fù)合體裝配可以正常起始，但不會(huì)完成，而當(dāng)亮氨酸調(diào)節(jié)的SAM合成酶水平恢復(fù)正常，細(xì)胞內(nèi)甲基供體SAM不再缺乏時(shí)，細(xì)胞分裂也隨即恢復(fù)正常。很明顯，細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂與胞內(nèi)SAM濃度是密切相關(guān)的。
[0004]通用甲基供體SAM受甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲基后，生成的通用產(chǎn)物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein，SAH), SAH被發(fā)現(xiàn)對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的甲基化過(guò)程具有普遍的反饋抑制作用，是轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，SAH通過(guò)SAH水解酶(SAH hydrolase, SAHH)催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸(Parveen, N.;Cornell, K.A..Me thyIth1adenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, acritical enzyme for bacterial metabolism.Mol Microb1l, 20117,9(I):7_20，)，而在大多數(shù)病原微生物的細(xì)胞內(nèi)，SAH的代謝則采用完全不同的方式一一通過(guò)S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocystein nucleosidase, SAHN)催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH進(jìn)一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和 4，5 二輕-2, 3-乙?；?4，5-dihydroxy-2, 3-pentaned1ne，DPD),高半胱氨酸最后通過(guò)幾種甲硫氨酸合成酶(MetH、MetE)重新生成SAM的前體一一甲硫氨酸，或者經(jīng)過(guò)多步酶催化生成半胱氨酸。
[0005]目前，已報(bào)道的測(cè)定SAM的方法有高效液相色譜法(HPLC)，該方法存在色譜柱容易污染，分析價(jià)格昂貴的缺陷，分光光度法，谷勁松等研宄S-腺苷甲硫氨酸依賴(lài)的甲級(jí)轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)方法(谷勁松等，一種S-腺苷甲硫氨酸依賴(lài)的甲級(jí)轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)方法，高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(3):521~525)，該方法是依賴(lài)甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用將SAM分解為高半胱氨酸，再對(duì)高半胱氨酸顯色反應(yīng)，操作比較繁瑣，準(zhǔn)確度也不理想。由于樣品的基質(zhì)比較復(fù)雜，給檢測(cè)帶來(lái)了困難。因此，建立一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)使用的檢測(cè)方法，對(duì)研宄人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口商檢、政府管理部門(mén)等的迫切需要的，對(duì)食品、藥品、環(huán)境安全、生物樣品中的SAM含量準(zhǔn)確定量測(cè)定十分必要，對(duì)于SAM生產(chǎn)和藥理研宄也具有十分重要的意義。
[0006]生物酶電極傳感器是當(dāng)前開(kāi)發(fā)具有專(zhuān)一性、穩(wěn)定性、檢測(cè)速度快、選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛用于醫(yī)藥臨床、食品、環(huán)境及生物樣品檢測(cè)領(lǐng)域，而將甲基轉(zhuǎn)移酶固載在電極上用于SAM的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是將甲基轉(zhuǎn)移酶固載鉑電極上與電化學(xué)相結(jié)合，提供了一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒?，并?yīng)用檢測(cè)SAM中，采用電聚合法在鉑電極表面電聚合聚(3-噻吩乙酸)制備聚(3-噻吩乙酸)電極，然后將聚3-噻吩乙酸電極氨基化，再將甲基轉(zhuǎn)移酶固載在氨基化的電極上，制備得甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。
[0009]儀器與試劑
CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，電聚合體系:工作電極是直徑為3 mm的鉑盤(pán)電極，對(duì)電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲；實(shí)驗(yàn)采用三電極體系:鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極(SCE)，酶電極(GCE)為工作電極；KQ_250E型超聲波清洗器(坤峰超聲儀器有限公司)。
[0010]3-噻吩乙酸，三氟化硼乙醚(BFEE)，N-甲基吡咯烷酮，氯化亞砜，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，乙二胺，甲醇，戊二醛，甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.1.3)，DNA, SAM ;硫酸，磷酸鹽緩沖溶液，所用試劑均為分析純，水為高純水。
[0011]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0012]一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法，特征在于該方法具有以下工藝步驟:
(1)鉑電極預(yù)處理:將直徑為3mm的鉑盤(pán)電極，對(duì)電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥漿拋光打磨成鏡面，并在超聲清洗儀中先后用乙醇、水超聲清洗5 min，以清洗后的鉑盤(pán)電極做為工作電極，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度從-0.2到+1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，得到預(yù)處理鉑電極；
(2)聚3-噻吩乙酸膜電極制備:將含有3-噻吩乙酸的質(zhì)量百分濃度為35~45%的N-甲基吡咯烷酮溶液通入氮?dú)獬?5~20min除氧后，加入0.5-1.0 mL三氟化硼乙醚作為電解質(zhì)，將預(yù)處理電極放入，采用計(jì)時(shí)電流法在電壓為1.4 V，時(shí)間為70-90 s的條件下合成3-噻吩乙酸膜電極，將合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小時(shí)以除去電極上的溶劑，得到聚3-噻吩乙酸膜電極；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中，按如下組成的質(zhì)量百分濃度加入，氯化亞砜:60~75%，N, N- 二甲基甲酰胺:5~12%，混合均勾，將聚3-噻吩乙酸膜電極放入，室溫反應(yīng)24~30h，溫度升到55~60°C恒溫反應(yīng)4~5 h，滴加乙二胺:18~30%，再于55~60°C恒溫反應(yīng)2~3 h，取出電極，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌，于60°C干燥，放入質(zhì)量百分濃度為12%的戊二醛溶液中，超聲50~60min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極；
(4)甲基轉(zhuǎn)移酶固定液的制備:在反應(yīng)器中，按甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA質(zhì)量比為1:1加入，甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA溶解在pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液中，溶液中含甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA的濃度都在12~15mg/mL范圍內(nèi)，該溶液為甲基轉(zhuǎn)移酶固定液；
(5)固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法:取步驟(4)制備的甲基轉(zhuǎn)移酶固定液滴涂到步驟(3)制備的氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極上，滴涂的量為22~30 yL，在5~8°C干燥，即得固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。
[0013]固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的使用方法:
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的SAM標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為PH7.2的磷酸鹽緩沖溶液；
(2)將Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接CHI660B電化學(xué)工作站，采用計(jì)時(shí)電流法掃描該溶液，工作電壓為-1.1V，取不同濃度下SAM的峰電流值與SAM濃度做工作曲線(xiàn)；
(3)SAM的檢測(cè):用待測(cè)樣品代替步驟(I)中的SAM標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟(2)的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值Ζ Τ?Ρ工作曲線(xiàn)，得到待測(cè)樣品中SAM的含量。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是:
本發(fā)明采用電化學(xué)聚合制備含有豐富羧基的聚3-噻吩乙酸膜電極，然后在氨基化，再將甲基轉(zhuǎn)移酶固載上，制得固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。該固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器對(duì)SAM表現(xiàn)出很高選擇性和靈敏性，響應(yīng)電流與SAM的濃度在2~25 ymol/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.9990，檢測(cè)限為4.32X10_6mol/L，將本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器成功用于藥品、食品中SAM的檢測(cè)中，回收率在95.15-105.2%之間，因此本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
(I)鉑電極預(yù)處理:將直徑為3 mm的鉑盤(pán)電極，對(duì)電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥漿拋光打磨成鏡面，并在超聲清洗儀中先后用乙醇、水超聲清洗5 min，以清洗后的鉑盤(pán)電極做為工作電極，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度從-0.2到+1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，得到預(yù)處理鉑電極； (2)聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中分別加入1g的3-噻吩乙酸18mL的N-甲基吡咯烷酮溶解后，通入ISmin氮?dú)獬?，除氧后，加?.8 mL三氟化硼乙醚作為電解質(zhì)，將預(yù)處理電極放入，采用計(jì)時(shí)電流法在電壓為1.4 V，時(shí)間為80 s的條件下合成3-噻吩乙酸膜電極，將合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小時(shí)以除去電極上的溶劑，得到聚3-噻吩乙酸膜電極；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中，分別加入，氯化亞砜:5mL，N，N-二甲基甲酰胺:1.0mL，混合均勻，將聚3-噻吩乙酸膜電極放入，室溫反應(yīng)28h，溫度升到58°C恒溫反應(yīng)4.5 h，滴加乙二胺:2.0mL，再于60°C恒溫反應(yīng)2.5 h，取出電極，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌，于60°C干燥，放入質(zhì)量百分濃度為12%的戊二醛溶液中，超聲55min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極；
(4)甲基轉(zhuǎn)移酶固定液的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取650mg甲基轉(zhuǎn)移酶和650mgDNA于小燒杯中，加入20 mL左右pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液使其溶解，定量轉(zhuǎn)移到50.0 mL的容