一種熒光壽命測(cè)量方法及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及一種熒光壽命測(cè)量方法及裝置，用于檢測(cè)有激發(fā)光的照射引起的發(fā)射光 的壽命測(cè)量和成像的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，熒光壽命的測(cè)量和成像主要有兩種方法：一是使用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) (TCSPC)技術(shù)對(duì)熒光壽命進(jìn)行測(cè)量，這種方法采用光電倍增管或雪崩光電二極管作為探測(cè) 器，再配合點(diǎn)掃描方法，進(jìn)行熒光壽命成像。二是使用時(shí)間門（Time-gated)技術(shù)，用增強(qiáng)型 電荷耦合器件（ICCD)相機(jī)作為探測(cè)器，每個(gè)光脈沖激發(fā)后延遲一定時(shí)間收集熒光信號(hào)，多 次反復(fù)此過(guò)程延遲不同的時(shí)間，對(duì)熒光壽命進(jìn)行測(cè)量，再配合寬場(chǎng)成像方法，進(jìn)行熒光壽命 成像。
[0003] 然而，這兩種技術(shù)均必須使用脈沖激光作為光源，搭配光電倍增管（或雪崩光電 二極管）和增強(qiáng)型電荷耦合器件相機(jī)作為探測(cè)器，價(jià)格十分昂貴。另外采用這兩種方法還 需根據(jù)激發(fā)光源的照射來(lái)定時(shí)驅(qū)動(dòng)探測(cè)器件，光路復(fù)雜，調(diào)整及處理耗時(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種熒光壽命測(cè)量方法及裝置。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種熒光壽命測(cè)量方法，該方法包括 以下步驟：
[0006] (1)用激發(fā)光源激發(fā)待測(cè)熒光樣品；
[0007] (2)熒光樣品受激發(fā)光源激發(fā)后，開(kāi)始發(fā)光；成像裝置采集熒光圖像，并記錄采集 時(shí)間；獲得一系列焚光圖像；
[0008] (3)數(shù)據(jù)處理，將熒光圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖后，讀取灰度值；根據(jù)灰度值以及對(duì)應(yīng)的 采集時(shí)間，輸出熒光衰減曲線，得到熒光壽命。
[0009] 進(jìn)一步地，所述激發(fā)光源為脈沖光源或由開(kāi)關(guān)控制的連續(xù)光源；所述由開(kāi)關(guān)控制 的連續(xù)光源在激發(fā)熒光樣品后，通過(guò)開(kāi)關(guān)關(guān)閉。
[0010] 進(jìn)一步地，待測(cè)熒光樣品由多種熒光材料組成，樣品受到激發(fā)后，不同種熒光材料 分別形成熒光圖像。
[0011] -種熒光壽命測(cè)量裝置，所述裝置包括：
[0012] 載樣裝置，用于放置或者移動(dòng)要待測(cè)熒光樣品；
[0013] 激發(fā)裝置，設(shè)置有激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光以激發(fā)待測(cè)樣品；
[0014] 成像裝置，用于對(duì)待測(cè)樣品所發(fā)熒光進(jìn)行圖像采集并存儲(chǔ)；
[0015] 數(shù)據(jù)處理裝置，用于根據(jù)成像裝置中所采集的圖像計(jì)算熒光壽命。
[0016] 進(jìn)一步地，所述裝置還包括調(diào)整裝置，用于調(diào)整激發(fā)裝置與樣品裝置的相對(duì)位置， 以及成像裝置與樣品裝置的相對(duì)位置，以使得在成像裝置上獲得熒光圖像。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，熒光壽命測(cè)量和成像設(shè)備以一定的速度存儲(chǔ)熒光信號(hào)照片，這允許 以普通高速相機(jī)而不是光電倍增管或者增強(qiáng)型電荷耦合器件相機(jī)獲得短時(shí)段內(nèi)發(fā)生的光 的強(qiáng)度變化，從而得到樣品的熒光壽命。整個(gè)裝置簡(jiǎn)單，成本低，易操作，可以實(shí)現(xiàn)快速和高 通量實(shí)時(shí)在線測(cè)量。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為1號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的熒光衰減圖；
[0019] 圖2為1號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的衰減擬合圖；
[0020] 圖3為2號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的熒光衰減圖；
[0021] 圖4為2號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的衰減擬合圖；
[0022] 圖5為3號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的熒光衰減圖；
[0023] 圖6為3號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的衰減擬合圖；
[0024] 圖7為4號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的熒光衰減圖；
[0025] 圖8為4號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的衰減擬合圖；
[0026] 圖9為5號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的熒光衰減圖；
[0027] 圖10為5號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的衰減擬合圖。
【具體實(shí)施方式】 [0028] 實(shí)施例1
[0029] 把帶有1號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的基片固定在樣品架上，用一脈沖光源照射樣品，脈沖 重復(fù)頻率為1kHz。高速相機(jī)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行連續(xù)拍攝，每幀曝光時(shí)間為50us。所拍攝的系 列照片中，即出現(xiàn)與激發(fā)脈沖重頻相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)從強(qiáng)到弱的周期變化。從其 中任意選取從強(qiáng)到弱的熒光信號(hào)連續(xù)變化的照片共20張。截取照片中熒光物質(zhì)相應(yīng)的位 置，如圖1所示。再把每幀中所有像素的灰度值的總和對(duì)時(shí)間作圖，即得到熒光衰減曲線 圖，如圖2所示。
[0030] 然后用單指數(shù)衰減函數(shù)I(t) =Ibg+A*exp(-t/T)對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合，其中，Ibg 為背景光強(qiáng)，τ為待測(cè)物質(zhì)的熒光壽命。擬合得到1號(hào)待測(cè)物質(zhì)的熒光壽命值為149 μ s。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 把帶有2號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的基片固定在樣品架上，用一脈沖光源照射樣品，脈沖 重復(fù)頻率為1kHz。高速相機(jī)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行連續(xù)拍攝，每幀曝光時(shí)間為50us。所拍攝的系 列照片中，即出現(xiàn)與激發(fā)脈沖重頻相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)從強(qiáng)到弱的周期變化。從其 中任意選取從強(qiáng)到弱的熒光信號(hào)連續(xù)變化的照片共20張。截取照片中熒光物質(zhì)相應(yīng)的位 置，如圖3所示。再把每幀中所有像素的灰度值的總和對(duì)時(shí)間作圖，即得到熒光衰減曲線 圖，如圖4所示。
[0033] 首先用單指數(shù)衰減函數(shù)I (t) = Ibg+A *eXp (-t/ τ )對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合，其中，'為 背景光強(qiáng)，τ為待測(cè)物質(zhì)的熒光壽命。發(fā)現(xiàn)該樣品不能用單指數(shù)衰減函數(shù)擬合，用多（雙） 指數(shù)衰減函數(shù)
丨對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合。τ ;為第i個(gè)熒 光衰減通道的壽命。平均熒光壽命可通過(guò)
計(jì)算得。具體見(jiàn)圖4, 2號(hào)待測(cè)物質(zhì) 的第1個(gè)熒光衰減通道的壽命為136 μ s ;第2個(gè)熒光衰減通道的壽命為1046 μ s ;平均熒光 壽命為839 μ s。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 把帶有3號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的基片固定在樣品架上，用一脈沖光源照射樣品，按 照實(shí)施例1的方法進(jìn)行操作（每幀曝光時(shí)間為100 μ s，連續(xù)拍攝脈沖光源激發(fā)，重頻為 500 μ s)，得到如圖5所示的熒光衰減圖像。由于激發(fā)光源的脈沖重復(fù)頻率較高，致使待測(cè) 物質(zhì)熒光信號(hào)未衰減到較低值，下一激發(fā)脈沖已到達(dá)。
[0036] 這種情況下，可以用多段熒光衰減時(shí)間序列進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖6所示，采用 實(shí)施例2中的計(jì)算公式，得到的熒光壽命取平均值為200 μ s。
[0037] 實(shí)施例4
[0038] 把帶有4號(hào)待測(cè)熒光物質(zhì)的基片固定在樣品架上，用一脈沖光源照射樣品，按 照實(shí)施例1的方法進(jìn)行操作（每幀曝光時(shí)間為50 μ s，連續(xù)拍攝脈沖光源激發(fā)，重頻為 250 μ s)，得到如圖7所示的熒光衰減圖像。由于激發(fā)光源的脈沖重復(fù)頻率較高，致使待測(cè) 物質(zhì)熒光信號(hào)未衰減到較低值，下一激發(fā)脈沖已到達(dá)。
[0039] 這種情況下，可以用多段熒光衰減時(shí)間序列進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖8所示，采用 實(shí)施例2中的計(jì)算公式，得到的熒光壽命取平均值為147 μ s。
[0040] #
[0041] 實(shí)施例5
[0042] 本實(shí)施例同時(shí)測(cè)試多種待測(cè)熒光樣品的熒光壽命，按照實(shí)施例1所述的方法， 對(duì)5號(hào)樣品進(jìn)行激發(fā)脈沖照射后，拍攝到的時(shí)間序列熒光圖片，如圖9所示，三種不同熒 光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度衰減速度不同。對(duì)三種物質(zhì)對(duì)應(yīng)的照片的區(qū)域的灰度值選取出來(lái)， 分別用它們的灰度值對(duì)時(shí)間作圖，即得到熒光衰減曲線。然后分別對(duì)它們用單指數(shù)或者 多指數(shù)衰減函數(shù)進(jìn)行擬合，如圖10所示，得到A、B、C三種待測(cè)樣品的熒光壽命分別為 36. 6 μ Sj 69. 0 μ s, 281. 8 μ s〇
[0043] 對(duì)拍攝區(qū)域的每一個(gè)像素位置的灰度值隨時(shí)間的變化曲線都畫出來(lái)，并用單指數(shù) 或者多指數(shù)衰減函數(shù)擬合，即得到拍攝區(qū)域每一個(gè)像素位置的熒光壽命。再用灰度值或者 偽彩色，表示每一個(gè)像素位置的熒光壽命，重構(gòu)出該區(qū)域的熒光壽命成像圖。該技術(shù)可以擴(kuò) 展到防偽應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光壽命測(cè)量方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 用激發(fā)光源激發(fā)待測(cè)熒光樣品； (2) 熒光樣品受激發(fā)光源激發(fā)后，開(kāi)始發(fā)光；成像裝置采集熒光圖像，并記錄采集時(shí) 間；獲得一系列熒光圖像； (3) 數(shù)據(jù)處理，將熒光圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖后，讀取灰度值；根據(jù)灰度值以及對(duì)應(yīng)的采集 時(shí)間，輸出熒光衰減曲線，得到熒光壽命。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述激發(fā)光源為脈沖光源或由開(kāi)關(guān)控制 的連續(xù)光源；所述由開(kāi)關(guān)控制的連續(xù)光源在激發(fā)熒光樣品后，通過(guò)開(kāi)關(guān)關(guān)閉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，待測(cè)熒光樣品由多種熒光材料組成，樣品 受到激發(fā)后，不同種熒光材料分別形成熒光圖像。4. 一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法的裝置，其特征在于，所述裝置一般包括： 載樣裝置，用于放置或者移動(dòng)待測(cè)熒光樣品； 激發(fā)裝置，設(shè)置有激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光以激發(fā)待測(cè)樣品； 成像裝置，用于對(duì)待測(cè)樣品所發(fā)熒光進(jìn)行圖像采集并存儲(chǔ)； 數(shù)據(jù)處理裝置，用于根據(jù)成像裝置中所采集的圖像計(jì)算熒光壽命。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述裝置還包括調(diào)整裝置，用于調(diào)整激發(fā) 裝置與樣品裝置的相對(duì)位置，以及成像裝置與樣品裝置的相對(duì)位置，以使得在成像裝置上 獲得熒光圖像。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用簡(jiǎn)單配置進(jìn)行熒光壽命測(cè)試的方法和裝置。所述裝置包括載樣裝置、激發(fā)裝置、成像裝置和數(shù)據(jù)處理裝置，將熒光樣品放置在樣品裝置上，利用激發(fā)裝置的光源來(lái)激發(fā)樣品的熒光，然后關(guān)掉光源利用測(cè)量和成像裝置實(shí)時(shí)對(duì)樣品所發(fā)熒光進(jìn)行成像，得到系列熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖像，利用該系列圖像即可以計(jì)算出熒光壽命。相比較其他的方法和裝置，本發(fā)明裝置簡(jiǎn)單，成本低，易操作，可以實(shí)現(xiàn)快速和高通量實(shí)時(shí)在線測(cè)量。
【IPC分類】G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105300949
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510843039
【發(fā)明人】秦海燕, 彭笑剛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月26日