一種檢測多菌靈的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，尤其涉及一種多菌靈的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]多菌靈(Carbendazin),化學(xué)名稱2-(甲氧基氨基甲酰)苯并咪唑[2- (methoxy-carbanmoyl) -benzimidaxole],是一種高效低毒殺菌劑,可用于防治多種植物病害。多菌靈是蔬菜栽培過程中常用的一種農(nóng)藥，我國蔬菜產(chǎn)品出口量很大，農(nóng)藥殘留是一個(gè)很重要的限制指標(biāo)。因此定期對(duì)多菌靈殘留進(jìn)行檢測成為許多國家的監(jiān)控的必要手段。歐盟規(guī)定多菌靈在蔬菜中的最聞殘留限量(MRL)為0.1 mg/kg。
[0003]目前，檢測多菌靈的方法主要有:高效液相色譜法(HPLC)、色/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)、液/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS/MS)。薄層色譜法的缺陷是:操作過程復(fù)雜，時(shí)間長；操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；影響分析的干擾因素較多，結(jié)果重復(fù)性差。放射免疫法，高效液相色譜法、色/質(zhì)連用分析法、液/質(zhì)聯(lián)用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設(shè)備昂貴，樣品前處理復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，不易普及，檢測費(fèi)用高，特別是放射免疫法還需要配備放射源，有一定危險(xiǎn)性。鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測蔬菜植物中多菌靈含量的方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種多菌靈的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應(yīng)用靈活、方便的特點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明所述多菌靈的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的多菌靈系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)羊抗兔抗體、多菌靈抗體、發(fā)光溶液、洗滌溶液、包被溶液及封閉溶液；其特征在于:
所述酶標(biāo)板的各孔包被有以多菌靈與卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原濃度優(yōu)選10 μ g/mL。
[0006]所述卵清蛋白的分子量范圍優(yōu)選6.7KDa~6.8KDa。
[0007]所述多菌靈系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別是0mg/kg,0.01mg/kg,0.03mg/kg,0.09mg/kg,
0.27mg/kg和0.81mg/kg所述酶標(biāo)羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液,其工作濃度優(yōu)選為1:1000。
[0008]所述多菌靈抗體是由多菌靈與分子量范圍是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動(dòng)物制得的多克隆抗體，其工作濃度優(yōu)選為1:1000。
[0009]所述發(fā)光液是0.0lM魯米諾與0.0OlM對(duì)甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(體積比)H202的混合液。所述魯米諾為發(fā)光底物，對(duì)甲苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。
[0010]所述洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液。
[0011]所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉的溶液，pH為9.5。
[0012]所述封閉溶液是每升洗滌溶液中含1g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由386aa組成，分子量約43Kd)且加入重量分?jǐn)?shù)0.5% NaN3的溶液。
[0013]本發(fā)明試劑盒最大檢測范圍為0.01mg/kg~0.81mg/kg。
[0014]本發(fā)明試劑盒中涉及的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液、多菌靈抗體溶液、發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對(duì)本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是:
1、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液:以常規(guī)方法配制濃度分另Ij為0mg/kg,0.01mg/kg,0.03mg/kg,
0.09mg/kg,0.27mg/kg 和 0.81mg/kg 的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液；
2、酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液:酶標(biāo)羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用時(shí)用洗滌溶液配制成1:1000的工作濃度；
3、多菌靈抗體溶液:多菌靈抗體是用人工免疫抗原免疫動(dòng)物制得的多克隆抗體，將所得多菌靈抗體用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度；
4、發(fā)光溶液:是0.0lM魯米諾與0.0OlM對(duì)甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH =
8.8)和3/10000 (體積比)H2O2的混合液；
5、洗滌溶液:指含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH7.5,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；
6、包被溶液:1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調(diào)節(jié)pH為9.5 ;
7、封閉溶液配制:10gOVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為0.05%的NaN3。
[0015]本發(fā)明所述酶標(biāo)板的制備:
本發(fā)明所述酶標(biāo)板的包被方法是采用多菌靈-OVA在設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定的濃度，在4°C中過夜反應(yīng)包被。
[0016]本發(fā)明采用的是pH為9.5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發(fā)明酶標(biāo)板中所包被的多菌靈-卵清蛋白(OVA)在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗板，采用的包被抗原濃度為10 μ g/mL。
[0017]包被好的酶標(biāo)板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選卵清蛋白(OVA)，需加入NaN3防止變質(zhì)。
[0018]多菌靈抗體溶液和酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液的制備:
本發(fā)明中多菌靈抗體溶液、酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液濃度是決定本發(fā)明中萊克多巴胺酶聯(lián)免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0019]本發(fā)明中涉及的多菌靈抗體溶液可以用洗滌溶液配制成濃度為0.0Γ0.81mg/kg溶液；或用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度。
[0020]本發(fā)明中涉及的酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液優(yōu)選用洗滌溶液配制的濃度為1:1000。
[0021]按照上述多菌靈抗體溶液濃度和酶標(biāo)羊抗兔抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達(dá)到很好的線性范圍(標(biāo)準(zhǔn)線范圍可以達(dá)到0.0 lmg/kg~0.8 lmg/kg)及很好的檢測限(0.05mg/kg)。
[0022]發(fā)光溶液的配制:
本發(fā)明采用辣根過氧化酶標(biāo)記底物發(fā)光系統(tǒng)，主要是魯米諾-過氧化氫系統(tǒng)。
[0023]所述發(fā)光液是0.0lM魯米諾與0.0OlM對(duì)甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH= 8.8)和3/10000(體積比)H202的混合液。所述魯米諾為發(fā)光底物，對(duì)甲苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。
[0024]本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應(yīng)的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結(jié)合起來，利用酶催化底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測產(chǎn)物濃度。
[0025]本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確的點(diǎn)，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。有望在農(nóng)作物產(chǎn)品中的多菌靈殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0026]圖1為多菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1、免疫原、包被抗原的及抗體的制備 (I)免疫原的合成
將多菌靈與牛血清蛋白(BSA)采用對(duì)氨基苯甲酸法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。具體包括以下步驟:
a、稱取14mg(100 μ mol)對(duì)氨基苯甲酸(ABA)溶入1.5mL0.2M鹽酸中，然后稱取
8.3mg(120ymol)的亞硝酸鈉(NaNO2)溶在0.24mL的蒸餾水中，O— 4°C攪拌，將亞硝酸鈉(NaNO2)溶液逐滴加入到對(duì)氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)I小時(shí)，得溶液A ;
b、稱取34mg(100μ mol)多菌靈溶在5mL冰冷的硼砂緩沖(0.05M) (ρΗ8.5，含0.15Μ的NaCl)中，0-4°C攪拌，將上述的A溶液2mL逐滴加入到該溶液中，避光反應(yīng)2小時(shí)，得到桔黃色溶液；
C、把溶液加少量的硼酸晶體調(diào)pH至7.4，然后加入136mg(2ymol)CBSA (牛血清白蛋白)，同時(shí)加入160mg(834ymol)水溶性碳二亞胺(EDC)，48mg (417 μ mol) N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，得桔黃色溶液；
d、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，在0-4°C用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (0.01M, pH7.4)透析3天，其間每4-6小時(shí)換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時(shí)換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機(jī)凍干，得桔黃色固體粉末即為免疫原(多菌靈與牛血清蛋白的偶聯(lián)物)，-20°C保存，備用。
[0028](2)包被抗原的合成
將多菌靈與卵清蛋白(OVA)采用I，4-丁二醚法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。具體包括以下步驟:
a.稱取66mg卵清蛋白(OVA)溶于5mL50mM碳酸鹽(ρΗΙΟ.7)緩沖液中，然后向溶液中加入28 μ L (147.9 μ mol)的1，4-丁二醚(BDE)，室溫反應(yīng)24小時(shí)，得溶液A ;
b.稱取76mg(277.1ymol)多菌靈溶于Iml DMF(無水N-N 二甲基甲酰胺)中，再加lmL50mM碳酸鹽(ρΗΙΟ.7)緩沖液中，把溶液A通入氮?dú)?，隨后將多菌靈溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應(yīng)24小時(shí)，得淡黃色溶液；
c.將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，在0-4°C用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(0.01M, pH7.4)透析3天，其間每4-6小時(shí)換一次透析液；隨后用高純水透析3天，其間每4-6小時(shí)換一次透析液；透析完畢，用冷凍干燥機(jī)凍干，得白色固體粉末即為包被抗原(多菌靈與卵清蛋白的偶聯(lián)物)，-20°C保存，備用。
[0029](3)多菌靈多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以多菌靈與分子量范圍是6.7KDa?6.8KDa的牛血清蛋白的偶聯(lián)物為免疫原，首次免疫劑量為500 μ g/mL，首免時(shí)將免疫原溶于入等體積的生理鹽水和弗氏完全佐劑制成乳化劑，頸背部多點(diǎn)注射，以后免疫取劑量減半的免疫原溶于等體積的生理鹽水和弗氏不完全佐劑混合乳化，首免與二免間隔20天，以后每隔兩周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐劑