一種測(cè)定發(fā)酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明公開了一種測(cè)定發(fā)酵食品中痕量氨基甲酸乙醋化thyl carbamate,EC)的 方法，具體來(lái)說(shuō)是設(shè)及一種基于氣相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵食品中痕量氨基甲酸乙醋 的方法，屬于食品理化指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙醋，又稱尿燒，廣泛存在于各種發(fā)酵食品中，是一種潛在的致癌物質(zhì)， 可導(dǎo)致肺癌、淋己癌、肝癌和皮膚癌等多種疾病，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC)將 其歸為2A類致癌物，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FA0/WH0)食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì) (巧CFA)第64次會(huì)議建議，為了保障人類身體健康，應(yīng)盡可能降低發(fā)酵飲料和食品中氨基甲 酸乙醋的含量。
[0003] 已經(jīng)報(bào)道的氨基甲酸乙醋含量的測(cè)定主要集中于面包、酸牛奶、醬油等發(fā)酵食品 W及葡萄酒、蘋果酒、中國(guó)黃酒和日本清酒等酒精飲料等食品行業(yè)，采用的方法有氣相色譜 法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、紅外光譜法等。國(guó)家進(jìn)出口檢驗(yàn)檢驗(yàn) 局針對(duì)出口的黃酒、蒸饋酒中的氨基甲酸乙醋制定了氣相色譜法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 0285- 93)，此標(biāo)準(zhǔn)采用液液萃取法，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且檢測(cè)時(shí)采用外標(biāo)法，存在定量不夠準(zhǔn)確等缺 點(diǎn)，因此，隨著前處理和檢測(cè)技術(shù)的提高，此行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也亟需進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)。
[0004] 現(xiàn)有研究結(jié)果表明，氨基甲酸乙醋是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致肺癌、肝癌、皮膚 癌和淋己癌等多種癌癥，在生物體內(nèi)的代謝途徑主要有兩條，一條是醋酶代謝，另一條主要 與細(xì)胞色素 P450有關(guān)，進(jìn)入生物體后，約0.5%左右的氨基甲酸乙醋被細(xì)胞色素 P450氧化為 乙締基-氨基-甲酸乙醋，隨后形成乙締基-氨基-甲酸乙醋環(huán)氧化物，該種環(huán)氧化物在體內(nèi) 形成DNA加聚物，造成DNA雙鏈損壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變，約0.1 %的氨基甲酸乙醋被細(xì)胞色 素 P450氧化后形成的物質(zhì)能夠?qū)е翫NA雙鏈復(fù)制時(shí)錯(cuò)配，從而造成基因的嚴(yán)重缺失或突變。 因此，自上世紀(jì)六屯十年代發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵食品及酒精飲料中含有氨基甲酸乙醋W來(lái)，許多文 獻(xiàn)都報(bào)道了酒精飲料及發(fā)酵食品中氨基甲酸乙醋含量的檢測(cè)方法。
[0005] 無(wú)論是國(guó)外還是國(guó)內(nèi)的研究者，建立的分析方法多為氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用，或者是 液相色譜-巧光檢測(cè)器法。由于氨基甲酸乙醋的含量一般為卵m甚至卵b級(jí)別，含量較低，且 酒精飲料或者發(fā)酵食品的成分較為復(fù)雜，基質(zhì)干擾非常嚴(yán)重，因此，試樣都需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前 處理W及衍生化過(guò)程。氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法一般是采用兩種或兩種W上不同類型的固相 萃取小柱或者固相萃取與基質(zhì)分散萃取相結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行凈化，然后使用大量的溶劑洗脫 萃取液中的氨基甲酸乙醋，洗脫液濃縮后再行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)中使用大量的有機(jī)溶劑，分析成本 較高，且耗時(shí)繁瑣，難W實(shí)現(xiàn)大量樣品的批量測(cè)定。采用液相色譜-巧光檢測(cè)器法時(shí)，試樣需 經(jīng)過(guò)衍生化過(guò)程，反應(yīng)要求在酸性，且在避光條件下進(jìn)行，更為重要的是，該方法的重復(fù)性 和準(zhǔn)確度不夠高，可用于樣品的篩查，但難W實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中氨基甲酸乙醋的準(zhǔn)確測(cè)定。
[0006] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法化PLC-MS/MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)是近年來(lái) 發(fā)展起來(lái)的一種色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。兩種方法由于具有樣品前處理簡(jiǎn)單、操作方便、清潔 實(shí)驗(yàn)等明顯優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、化工、冶金、地質(zhì)、水文、±壤、電子工業(yè)、食品飲 料、臨床化驗(yàn)等科學(xué)研究領(lǐng)域。在發(fā)酵食品及酒精飲料中EC的測(cè)定領(lǐng)域，研究者也嘗試采用 運(yùn)兩種分析技術(shù)建立了檢測(cè)方法。為此，本專利創(chuàng)新采用GC-MS/MS對(duì)發(fā)酵食品中痕量氨基 甲酸乙醋行量化分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供一種采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵 食品中痕量氨基甲酸乙醋含量的方法，該方法能準(zhǔn)確檢測(cè)發(fā)酵食品中痕量氨基甲酸乙醋的 含量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，基質(zhì)干擾少。
[0008] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0009] -種測(cè)定發(fā)酵食品中痕量氨基甲酸乙醋的方法，其特征在于，所述方法包括W下 步驟：
[0010] (1)內(nèi)標(biāo)溶液的制備：WD5-氨基甲酸乙醋D5-EC為內(nèi)標(biāo)物，使用乙臘為溶劑，制備 內(nèi)標(biāo)溶液；
[0011] (2)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備氨基甲酸乙醋EC標(biāo)準(zhǔn)品為目標(biāo)物，使用乙臘為溶劑， 經(jīng)逐級(jí)稀釋制備成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，然后分別加入一定量的內(nèi)標(biāo)溶液，制備成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
[0012] (3)樣品溶液的制備:準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的食物樣品，加一定體積的水進(jìn)行超聲萃 取，得到萃取液;然后使用C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，得到凈化液;再W二氯甲燒為溶劑，使 用娃藻±固相萃取柱對(duì)凈化液進(jìn)行反萃取，得到淋洗液;最后對(duì)淋洗液進(jìn)行濃縮，得樣品溶 液；
[OOU] (4)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析：用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀GC-MS/MS對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液和樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)分析；
[0014] (5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制及樣品結(jié)果的計(jì)算。
[0015] 在W上方法中，所述的內(nèi)標(biāo)溶液的制備包括W下步驟：
[0016] (1)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.5g D5-EC，精確至0.1 mg，于lOOmL的容量瓶中，用乙臘 溶解并定容至刻度；
[0017] (2)內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確移取O.lmL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于lOOmL的容量瓶中，用乙臘稀釋并定 容至刻度。
[0018] 另外，所述的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備包括W下步驟：
[0019] (1)-級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.5g EC，精確至0.1 mg，于lOOmL的容量瓶中，用乙 臘溶解并定容至刻度；
[0020] (2)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確移取O.lmL-級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于lOOmL的容量瓶中，用乙 臘稀釋并定容至刻度；
[0021] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別準(zhǔn)確移取二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液15化、3化L、60化、120化、240化、 480化和96化L，至lOOmL的容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入5(Κ)化內(nèi)標(biāo)溶液，用乙臘稀釋并定容至 刻度，得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
[0022] 進(jìn)一步，所述的樣品溶液的制備包括W下步驟：
[0023] (1)樣品萃取:準(zhǔn)確稱取lOg食物樣品，于100血錐形瓶中，并加入40血超純水和200 化內(nèi)標(biāo)溶液，使用縱滿混合器將樣品分散均勻，再置于超聲波發(fā)生器內(nèi)超聲萃取20min，得 到萃取溶液；
[0024] (2)萃取液凈化:預(yù)先對(duì)規(guī)格為2g/10mL的C18SPE小柱進(jìn)行活化，即先加入lOmL甲 醇，抽干，然后再加入lOmL超純水，快速抽下，并使C18小柱上篩板留有少量水，待準(zhǔn)備好 C18SPE小柱后，移入lOmL萃取液，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，待小柱上篩板留有少量 溶液時(shí)，再加入lOmL混合溶劑9mL超純水+lmL甲醇進(jìn)行淋洗，使其保持1滴/秒左右的速度滴 下，收集淋洗液，視為凈化液；
[0025] (3)凈化液反萃取:預(yù)先對(duì)填料為20g的娃藻±SPE小柱進(jìn)行活化，即移入50mL二氯 甲燒進(jìn)行淋洗活化，盡量抽干，待SI^小柱準(zhǔn)備好后，將上述凈化液全部移入SPE小柱，用一 濃縮瓶接收淋洗液;然后再用70mL二氯甲燒多次對(duì)小柱進(jìn)行淋洗，依靠二氯甲燒密度比水 大的特征，自行滴下，收集所有留下來(lái)的液體，視為淋洗液；
[00%] (4)淋洗液濃縮:在55°C、常壓條件下，對(duì)淋洗液濃縮到ImL左右，得到樣品進(jìn)樣溶 液。
[0027]其中，所述的GC-MS/MS分析，其儀器分析條件為:采用規(guī)格為30m X 0.25mm X 0.25μ m的HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱;載氣為氮?dú)?，恒流速度?. OmL/min;進(jìn)樣方式:進(jìn)樣量為化 L，脈沖不分流，進(jìn)樣脈沖壓力為25psi，時(shí)間為Imin;進(jìn)樣口溫度為240°C ;傳輸線溫度為260 °C ;升溫程序?yàn)槌跏紲囟葹?0°C，W5°C/min的速率升高至150°C，再Wl0°C/min的速率升高 至 240°C，保持 5min，
[00%]其質(zhì)譜分析條件為：電離方式為EI源，正離子模式;離子源溫度:230°C ;四極桿溫 度:均為150°C ;碰撞氣:氮?dú)?，流?.5mL/min，載氣氮?dú)饬魉贋?.25mL/min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM 模式，詳細(xì)參數(shù)列于下表：
[0029] 目標(biāo)物的MRM參數(shù)情況
[0030]
[0031] 進(jìn)一步在W上方法中，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計(jì)算如下：W標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中 EC與D5-EC濃度之比為橫坐標(biāo)，W色譜圖中EC與D5-EC峰面積之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸 分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將相同條件下測(cè)得的樣品溶液中EC與D5-EC色譜峰面積比，代入 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)下列公式求得發(fā)酵食品中痕量EC的含量：
[0032]
[0033] 式中；
[0034] W一一發(fā)酵食品中EC的含量，單位為微克每千克yg/kg;
[0035] A--EC的峰面積；
[0036] As--D5-EC的峰面積；
[0037] b一一標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距；
[003引 Ms--添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，單位為微克yg;
[0039] a--標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；
[0040] Μ一一發(fā)酵食品的質(zhì)量，單位為支。
[0041] 有益效果:本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)樣品處理方法及色譜質(zhì)譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化確 認(rèn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)良效果：
[0042] (1)本發(fā)明方法創(chuàng)新使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵食品中痕量EC的含量，解 決了發(fā)酵食品中EC水平低，W及復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的分析干擾嚴(yán)重等因素的影響。
[0043] (2)本發(fā)明方法針對(duì)EC極性較強(qiáng)的特