一種hbv表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法，本發(fā)明采用時(shí)間分辨免疫熒光分析法，TRFIMA應(yīng)用鑭系元素作為示蹤劑，標(biāo)記抗原或抗體，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢出波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾；另外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的板架為黑色，使得陰性樣本與空白對(duì)照的熒光本底大大降低，進(jìn)而進(jìn)一步地提高了試劑盒的靈敏度；同時(shí)本試劑盒采用特定的抗?HBs單克隆抗體包被反應(yīng)板，鑭系元素離子標(biāo)記的特定的抗?HBs多克隆抗體，使得本發(fā)明的試劑盒相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好、精密度更高，同時(shí)本發(fā)明有效地控制了試劑盒成本，制造成本遠(yuǎn)低于同等靈敏度的進(jìn)口試劑盒。
【專利說明】
一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及病毒蛋白免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免 疫熒光檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一種嗜肝病毒，是肝病毒家族的DNA逆 轉(zhuǎn)錄病毒，于1965年被丹娜發(fā)現(xiàn)，被稱之為丹式顆粒。主要存在于肝細(xì)胞并損害肝細(xì)胞，該 病原體可通過血液，母嬰和性傳播感染機(jī)體，引起肝細(xì)胞炎癥、壞死、纖維化，損害肝臟，弓丨 發(fā)乙型病毒性肝炎疾病，簡(jiǎn)稱乙肝。乙型病毒性肝炎分急性和慢性兩種。急性乙型肝炎在成 年人中90%可自愈，而慢性乙型肝炎表現(xiàn)不一，分為慢性乙肝攜帶者、慢性活動(dòng)性乙型肝 炎、乙肝肝硬化等。HBV在全世界范圍內(nèi)均有流行，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人感染過HBV病 毒，其中3億以上的人群為慢性HBV攜帶者，迄今為止，每年仍有近100萬人死于HBV感染引起 的肝衰竭和肝癌。在我國，約有1億的HBV攜帶者，目前乙肝病毒攜帶率為7.18%，其中約三 分之一有反復(fù)肝損害，表現(xiàn)為活動(dòng)性的乙型肝炎或者肝硬化。肝流行范圍廣，治療困難，對(duì) 人體造成的危害大。首先，乙肝的傳染性極強(qiáng)。乙肝病毒由質(zhì)地堅(jiān)硬的外殼包被，保護(hù)病毒 不受外界惡劣環(huán)境侵害，使其生命力極其頑強(qiáng)，它可通過患者排出的各種體液傳染給健康 的人群。其次，乙肝的治愈非常困難，雖然現(xiàn)在市面上針對(duì)乙肝治療的藥品很多，但真正治 愈的特效藥品很少。此外，乙肝容易發(fā)生惡變，據(jù)統(tǒng)計(jì)，HBV攜帶者如果不加以治療，31.6% ~60.1 %將會(huì)轉(zhuǎn)化成慢性肝炎，而20.8 %~56.3 %的慢性肝炎會(huì)惡化變成肝硬化，肝硬化 患者如不及時(shí)治療就會(huì)有16%~51.1%的患者轉(zhuǎn)化為肝癌，危及生命。乙肝還具有突發(fā)性， 乙肝病毒在人體內(nèi)存在，具有一定的潛伏期，不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外界條件成熟，就可突然間發(fā) 作，并且不可抑制。對(duì)HBV的防治成為全世界亟待解決的問題。在尚未找到較好的治療方法 之前，對(duì)乙肝病毒的檢測(cè)和預(yù)防就顯得尤為重要。
[0003] 近年來臨床上應(yīng)用較多的乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析 法（Enzyme Immunoassay，EIA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Chemilumineseent Immunoassay, CLIA)和時(shí)間分辨免疫焚光分析法（Time-resolved Immunofluorometric Assay ,TRFIMA) 〇 EIA的優(yōu)點(diǎn)在于其無污染、操作簡(jiǎn)單、試劑有效期長、特異性好等，但由于其敏感性相對(duì)較 低，測(cè)定范圍相對(duì)較窄等缺點(diǎn)，限制了其在微量免疫定量分析中的應(yīng)用。CLIA的優(yōu)點(diǎn)在于其 敏感性高、測(cè)定范圍寬，但由于大多數(shù)板式CLIA試劑盒仍采用EIA相同的酶促反應(yīng)，以辣根 酶或堿性磷酸酶交聯(lián)抗體，使用魯米諾或金剛烷等作為底物，檢測(cè)的是動(dòng)態(tài)發(fā)光，導(dǎo)致檢測(cè) 信號(hào)值衰減較快、高濃度和低濃度信號(hào)衰減速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低 端檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。利用時(shí)間分辨免疫熒光分析法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗 原是非常好的技術(shù)方案，但是國內(nèi)生產(chǎn)的HBsAg檢測(cè)試劑盒的靈敏度只能做到0.1IU/ml左 右，而進(jìn)口試劑的靈敏度可以達(dá)到0. 〇5IU/ml，臨床檢測(cè)對(duì)試劑盒靈敏度的要求逐漸提高， 合適成本范圍內(nèi)，提升國產(chǎn)試劑盒的靈敏度迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，提出一種特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精密度高、 重復(fù)性好的HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒;具備和進(jìn)口發(fā)光試劑相似的檢測(cè) 靈敏度與特異性，但成本低于進(jìn)口發(fā)光試劑;使得HBsAg的靈敏度達(dá)到:adr亞型0.05IU/ml; adw亞型0.05IU/ml ;ay亞型0· lIU/ml。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0006] 一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還包括乙型肝 炎表面抗原校準(zhǔn)品和鑭系元素離子標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體，所述包被反應(yīng)板為吸附有 抗-HBs單克隆抗體的微孔板。
[0007] 進(jìn)一步地，上述包被反應(yīng)板包括相互配合的板架和酶標(biāo)板，所述板架設(shè)有多個(gè)與 酶標(biāo)板配合的通孔，且通孔深度足夠?qū)⒚笜?biāo)板不同微孔之間光線完全阻隔;優(yōu)選地，上述的 板架為完全不透光的材料(更優(yōu)選為黑色聚苯乙烯）制作，所述酶標(biāo)板為經(jīng)鈷60輻照30天 后，將抗-HBs IgM抗體和抗-HBs IgA抗體以質(zhì)量比2:5混合，使用碳酸鹽緩沖液稀釋至5-20 yg/mL后以IOOyL/孔加入酶標(biāo)板內(nèi)，包被過夜后經(jīng)洗滌、封閉、干燥程序而獲得;本發(fā)明的包 被反應(yīng)板，僅僅在微孔底部為良好透光，使得陰性樣本與Blank的熒光本底大大降低，信噪 比顯著提高；同時(shí)在酶標(biāo)板微孔包被抗體前，使用了特定輻照，使得酶標(biāo)板微孔表面發(fā)生了 氧化，產(chǎn)生了某些含氧的活性基團(tuán)改善了對(duì)包被生物分子的親水性與化學(xué)反應(yīng)性能，使得 其吸附性大大增加，從而在不改變檢測(cè)的特異性情況下明顯提高檢測(cè)的敏感性和均一性， 進(jìn)而進(jìn)一步提高了試劑盒的靈敏度。
[0008] 進(jìn)一步地，上述的板架的高度和酶標(biāo)板完全匹配，使得板架和酶標(biāo)板組合后，不同 微孔之間完全沒有光線的相互干擾，板架的高度優(yōu)選為1-1.5cm，板架上的通孔的邊緣的相 互距離為0.6-1.2mm。
[0009 ]進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。
[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒中所述鑭系元素離子為EU3+、Tb 3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種； 更優(yōu)選地，所述鑭系元素離子為Eu3+。
[0011] 優(yōu)選地，所述熒光增強(qiáng)液含有β_二酮類化合物或芳香胺類化合物。
[0012] 另一方面，本發(fā)明還提供一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0013]步驟1制備預(yù)處理包被反應(yīng)板：
[0014] 使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過鈷60輻 照30天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用；
[0015] 步驟2抗-HBs單克隆包被板的獲得：
[0016] 將抗-HBs IgM抗體和抗-HBs IgA抗體以質(zhì)量比2: 5混合，使用緩沖液稀釋至5-20μ g/mL后加入步驟1獲得的預(yù)處理包被反應(yīng)板的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，以100μL7孔包被過夜，然后經(jīng) 洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用；
[0017]步驟3鑭系元素離子標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體的獲得：
[0018]將抗-HBs多克隆抗體經(jīng)緩沖液透析后，與鑭系元素離子以3:1的比例混合，靜置 22-24小時(shí)后經(jīng)SephacryI S-200HR分離柱，再經(jīng)過疏水柱去除多聚體，獲得鑭系元素離子 標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體；
[0019]步驟4乙型肝炎表面抗原校準(zhǔn)品的獲得：
[0020] 采用HBsAg WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品00/588和03/262組成的線性系列來標(biāo)定陽性血漿制備 的HBsAg企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的HBsAg企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定HBsAg重組抗原，然后稀釋成0、 0·05、0·2、2、20 及 160IU/mL 的 HBsAg 校準(zhǔn)品；
[0021 ]步驟5熒光增強(qiáng)液的配制：
[0022]以無水乙醇溶解β-ΝΤΑ、TOPO，再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40 °C溶解后，加入 乙酸、Ttiton X-100，調(diào)PH至3·2，定容后保存?zhèn)溆茫?br>[0023]步驟6組裝各個(gè)組分，獲得HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。
[0024] 優(yōu)選地，上述鑭系元素離子為Eu3+。
[0025] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0026] 本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，TRFIMA應(yīng)用鑭系元素作為示蹤劑， 標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢出波 長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的提高了靈敏 度;另外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的為完全不透光的板架和相應(yīng)配合的酶標(biāo)板組成，使得陰性 樣本與Blank的熒光本底大大降低，信噪比顯著提高，酶標(biāo)板包被采用特殊輻照，使得包被 效果顯著提高，進(jìn)而進(jìn)一步地提高了試劑盒的靈敏度；同時(shí)本試劑盒采用特定的抗-HBs單 克隆抗體包被反應(yīng)板，鑭系元素離子標(biāo)記的特定的抗-HBs多克隆抗體，使得本發(fā)明的試劑 盒相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好、精密度更高、重復(fù)性更好，同時(shí)有效地控制了試 劑盒成本。
【附圖說明】
[0027]圖1為利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行HBV表面抗原檢測(cè)的檢測(cè)原理示意圖；
[0028] 圖2為實(shí)施例二中全部樣本測(cè)值線性回歸分析圖；
[0029] 圖3為實(shí)施例二中線性范圍內(nèi)陽性樣本測(cè)值線性回歸分析圖；
[0030] 圖4為本發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的板架示意圖；
[0031] 圖5為發(fā)明的試劑盒中包被反應(yīng)板的整體示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]本發(fā)明提供了一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板， 還包括乙型肝炎表面抗原校準(zhǔn)品和鑭系元素離子標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體，所述包被反應(yīng) 板為吸附有抗-HBs單克隆抗體的微孔板。
[0033] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0034] 實(shí)施例一 HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒的制備 [0035]使用Eu3+作為熒光標(biāo)記物制備試劑盒，具體操作如下：
[0036] 1.制備包被反應(yīng)板:本發(fā)明的包被反應(yīng)板和現(xiàn)有技術(shù)中的包被反應(yīng)板均不同，在 制備過程中使用特制模具，整體的板架采用完全不透光的黑色聚苯乙烯制作，底部設(shè)有和 酶標(biāo)板相應(yīng)孔徑的通孔(如圖4所示）；酶標(biāo)板則采用透光優(yōu)秀的材料制備，在包被抗體前， 經(jīng)鈷60輻照30天，獲得高吸附性后，與板架組裝，獲得僅僅微孔底部透光的高吸附性預(yù)處理 包被反應(yīng)板備用，如附圖5所示。
[0037] 2.抗-HBs單克隆包被板的獲得:將抗-HBs IgM抗體和抗-HBs IgA抗體以質(zhì)量比2: 5混合，使用碳酸鹽緩沖液稀釋至15yg/mL后加入上述步驟1中獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板的微 孔內(nèi)，IOOyL/孔，包被過夜后經(jīng)洗滌、封閉、干燥等程序，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)， 冷減備用。
[0038] 3.抗-HBs多克隆抗體銪標(biāo)記物的獲得:將抗-HBs多克隆抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析 后，與DTTA-Eu以3:1的比例混合，靜置22-24小時(shí)后經(jīng)Sephacryl S-200分離柱分離DTTA-Eu 和Ab-Eu，再經(jīng)過疏水柱去除多聚體，獲得銪標(biāo)記的多克隆抗體。
[0039] 4.乙型肝炎表面抗原校準(zhǔn)品的獲得:采用HBsAg WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品00/588和03/262 組成的線性系列來標(biāo)定陽性血衆(zhòng)制備的HB s Ag企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的HB sAg企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)定HBsAg重組抗原，然后稀釋成0，0.05，0.2，2，20，160IU/mL的HBsAg校準(zhǔn)品。
[0040] 5.熒光增強(qiáng)液的配制：以無水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和三 蒸水，40 °C溶解后，加入乙酸、Ttiton Χ-100，調(diào)PH至3.2，定容。
[0041] 上述組分制備完畢后，加入緩沖液、洗滌液等其他試劑盒組分，制備得到HBV表面 抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。
[0042] 實(shí)施例二本發(fā)明的試劑盒與進(jìn)口發(fā)光試劑的比較實(shí)驗(yàn)
[0043]利用本發(fā)明的HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒與美國Abbott(雅培)公 司乙型肝炎病毒表面抗原定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法)在三家醫(yī)院同時(shí) 檢測(cè)了 1509例臨床樣本，其中包括陽性樣本771例，陰性樣本738例（其中包括干擾樣本236 例）。干擾因素包括CMV/EB/HAV/HCV/HIV/TP/HSV/HBsAb/ANA/RF/孕婦(HCG)。
[0044]全部樣本測(cè)值線性回歸分析:三家醫(yī)院臨床研究共檢測(cè)有效樣本1509例，其中有 21例樣本稀釋100倍后檢測(cè)值仍高于線性檢測(cè)范圍（本發(fā)明試劑推薦的最大稀釋倍數(shù)為100 倍），有5份初測(cè)均高于雅培和本發(fā)明試劑線性檢測(cè)范圍，但余量不足未能完成稀釋檢測(cè)，另 有4份初測(cè)即高于雙方檢測(cè)范圍的陽性干擾樣本，此30例不計(jì)入回歸分析，故對(duì)1479例樣本 兩方試劑檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸及定量相關(guān)性分析，以參比試劑的測(cè)定數(shù)值為橫坐標(biāo)，考 核試劑的測(cè)定數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸及相關(guān)性 分析，結(jié)果圖2所示。
[0045] 線性范圍內(nèi)陽性樣本測(cè)值線性回歸分析:本實(shí)施例中共檢測(cè)771例陽性樣本，其中 583例檢測(cè)結(jié)果在兩方試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)583例樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸及定量相關(guān) 性分析，以參比試劑的測(cè)定數(shù)值為橫坐標(biāo)，考核試劑的測(cè)定數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸及相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。
[0046] 相對(duì)符合率分析:根據(jù)參比試劑和考核試劑的參考值范圍（兩試劑盒參考值范圍 均為0~0.05IU/mL:將濃度計(jì)算值大于等于0.051 U/mL的結(jié)果判定為參比試劑的陽性，小 于0.05IU/mL的結(jié)果判定為參比試劑的陰性;對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行四格表分析，結(jié)果如表1所示：
[0047] 表 1
[0049] 本發(fā)明"HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒"，相比參比試劑美國雅培公 司"乙型肝炎病毒表面抗原定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法)"，根據(jù)四格表計(jì) 算本發(fā)明的試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)結(jié)果如表2:
[0050] 表 2
L0052」由本買施例的買驗(yàn)π」以證買，本友明的冊(cè)￥表_抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑 盒在相對(duì)較低的制作成本下，相較于國外先進(jìn)的檢測(cè)試劑盒，靈敏度相似，檢測(cè)效果穩(wěn)定準(zhǔn) 確。
[0053]綜上所述，本試劑盒采用的是時(shí)間分辨免疫熒光分析法，TRFMA應(yīng)用鑭系元素作 為示蹤劑，標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光， 同時(shí)檢出波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大的 提高了靈敏度;另外，本發(fā)明的包被反應(yīng)板的板架為黑色;使得陰性樣本與Blank的熒光本 底大大降低，信噪比顯著提高，進(jìn)而進(jìn)一步地提高了試劑盒低端的靈敏度；同時(shí)本試劑盒采 用特定的抗-HBs單克隆抗體包被反應(yīng)板，鑭系元素離子標(biāo)記的特定的抗-HBs多克隆抗體， 使得本發(fā)明的試劑盒相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好、精密度更高、重復(fù)性更好，同 時(shí)本發(fā)明有效地控制了試劑盒成本，制造成本遠(yuǎn)低于同等靈敏度的進(jìn)口試劑盒。
[0054]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，其特征在于，還 包括乙型肝炎表面抗原校準(zhǔn)品和鑭系元素離子標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體，所述包被反應(yīng)板 為吸附有抗-HBs單克隆抗體的微孔板。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述包被反應(yīng)板包括相互配合的板架和 酶標(biāo)板，所述板架設(shè)有多個(gè)與酶標(biāo)板配合的通孔。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的板架為完全不透光的材料制作， 所述酶標(biāo)板為經(jīng)鈷60輻照30天后，將抗-HBs IgM抗體和抗-HBs IgA抗體以質(zhì)量比2:5混合， 使用碳酸鹽緩沖液稀釋至5_20yg/mL后以lOOyL/孔加入酶標(biāo)板內(nèi)，包被過夜后經(jīng)洗滌、封 閉、干燥程序而獲得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+、 Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光增強(qiáng)液含有β-二酮類化合物或 芳香胺類化合物。8. -種制備如權(quán)利要求4所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟:步驟1制備 預(yù)處理包被反應(yīng)板： 使用黑色聚苯乙烯制備板架，預(yù)留與酶標(biāo)板相互配合的通孔;酶標(biāo)板經(jīng)過鈷60輻照30 天后，與板架配合組裝，獲得預(yù)處理包被反應(yīng)板，備用； 步驟2抗-HBs單克隆包被板的獲得： 將抗-HBs IgM抗體和抗-HBs IgA抗體以質(zhì)量比2:5混合，使用緩沖液稀釋至5-20yg/mL 后加入步驟1獲得的預(yù)處理包被反應(yīng)板的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，以l〇〇yL/孔包被過夜，然后經(jīng)洗 滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用； 步驟3鑭系元素離子標(biāo)記的抗-HBs多克隆抗體的獲得： 將抗-HBs多克隆抗體經(jīng)緩沖液透析后，與鑭系元素離子以3:1的比例混合，靜置22-24 小時(shí)后經(jīng)Sephacryl S-200HR分離柱，再經(jīng)過疏水柱去除多聚體，獲得鑭系元素離子標(biāo)記的 抗-HBs多克隆抗體； 步驟4乙型肝炎表面抗原校準(zhǔn)品的獲得： 采用HBsAg WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品00/588和03/262組成的線性系列來標(biāo)定陽性血漿制備的 HBsAg企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，使用經(jīng)標(biāo)化的HBsAg企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定HBsAg重組抗原，然后稀釋成0、 0·05、0·2、2、20 及 160IU/mL 的 HBsAg 校準(zhǔn)品； 步驟5熒光增強(qiáng)液的配制： 以無水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入令苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40°C溶解后，加入乙 酸、Ttiton X-100，調(diào)PH至3 · 2，定容后保存?zhèn)溆茫? 步驟6組裝各個(gè)組分，獲得HBV表面抗原時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105938144SQ201610256459
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】戶元林, 李榮娥, 周娟
【申請(qǐng)人】蘇州新波生物技術(shù)有限公司