一種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)生物傳感器的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于電化學(xué)生物檢測(cè)領(lǐng)域，解決了大腸桿菌特異性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的制備問(wèn)題。要點(diǎn)如下：首先該電化學(xué)傳感器以玻碳電極為基底電極，將制備的氧化石墨烯滴加在玻碳電極表面，在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原，之后將電極浸泡在氯金酸溶液中，通過(guò)電化學(xué)還原在玻碳電極的表面覆蓋一層金納米薄膜，然后，利用探針DNA的端氨基與金納米粒子之間的金氨共價(jià)鍵和靜電吸附作用，將探針DNA固定在電極表面，完成傳感器的制備。實(shí)驗(yàn)表明，這兩種修飾材料極大的增加了電子在電極表面的傳輸速率，同時(shí)增大電極的電活化面積，保證了傳感器的靈敏度及檢測(cè)限，因此它在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域?qū)⒂芯薮蟮膽?yīng)用潛力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及了一種新型高靈敏度與檢測(cè)限的大腸桿菌特異性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的制備問(wèn)題?！颈尘凹夹g(shù)】[00〇2]石墨稀(graphene)是碳原子以sp2雜化方式連接成的二維晶體，由正六邊形的晶格組成，每個(gè)碳原子通過(guò)〇鍵與其他三個(gè)碳原子相連，這些較強(qiáng)的C-C鍵使得石墨烯具有優(yōu)良的剛性結(jié)構(gòu)。每個(gè)碳原子中未成鍵的31電子在與平面垂直的方向上形成大的31軌道且31電子可以在晶體中自由移動(dòng)，這便使得石墨烯具有良好的導(dǎo)電性。因此常用作電化學(xué)電極的修飾材料。
[0003]電化學(xué)DNA傳感器在DNA檢測(cè)中具有重要的位置，隨著科技的進(jìn)步電化學(xué)DNA傳感器向著高精準(zhǔn)、高選擇性、低成本和小型化等方向發(fā)展。在電化學(xué)DNA傳感器的制作過(guò)程中， 基于DNA的直接氧化反應(yīng)的方法是最為經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的。石墨烯和納米金修飾的電極可以對(duì)DNA 中的四種堿基(腺嘌呤A、胞嘧啶C、鳥(niǎo)嘌呤G和胸腺嘧啶T)進(jìn)行同時(shí)測(cè)定并且互不干擾。此外基于DNA與石墨烯或G0的3T-3T電子的相互作用、靜電作用以及疏水作用也可構(gòu)建電化學(xué)DNA 傳感器。因此，電化學(xué)法可以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷的分析檢測(cè)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了一種操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的電化學(xué)DNA傳感器，并且實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌目標(biāo)DNA的檢測(cè)。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括:
[0005](1)氧化石墨烯的制備及電化學(xué)還原
[0006]本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Hummers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀.稱(chēng)取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。將制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過(guò)打磨并超聲清洗過(guò)的玻碳電極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。(2)AuNPs的電沉積
[0007]將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置氯金酸溶液中。采用電化學(xué)方法沉積 300s，可以在電極表面形成一層致密的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗，最后用氮?dú)獯蹈?，即完成AuNPs的電沉積?！揪唧w實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
[0009](1)氧化石墨烯的制備及電化學(xué)還原在冰水浴條件下，取濃硫酸60mL加入到盛有 2.0g石墨粉和2.0g硝酸鈉的三口燒瓶中，保證燒瓶?jī)?nèi)溫度維持在4°C左右。然后將研磨后的 12.0g高錳酸鉀加入其中，將體系加熱到35°C，保持90分鐘，以2滴每秒的速度加入80mL二次水。然后將混合物加熱到95°C冷凝回流，保持1.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后向其中加入超純水200mL，待溶液溫度自然降溫至50°C后加入10mL30%的過(guò)氧化氫，反應(yīng)完成得到亮黃色懸濁液。經(jīng)離心清洗、透析去除產(chǎn)物中未反應(yīng)完全的雜質(zhì)及金屬離子，并將產(chǎn)物pH值調(diào)至7左右。 真空干燥后研磨得到產(chǎn)物氧化石墨烯粉末。稱(chēng)取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于 lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。用移液槍取15此滴加在預(yù)處理完成的玻碳電極表面，電極垂直倒置，室溫中自然晾干。之后用蒸餾水緩緩沖洗后放置在0.1M PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃描范_ 1.7V—0V，掃速50mV/s)，至峰形及峰電流值穩(wěn)定不變?yōu)橹?，完成氧化石墨稀的電還原。 [〇〇1〇] (2)AuNPs的電沉積將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以0.5M的硫酸溶液為溶劑配制。在-0.4V的電壓下電沉積300s，可以在電極表面形成一層致密的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面的進(jìn)一步增長(zhǎng)。最后用氮?dú)獯蹈?，放置備用?br>[0011](3)電化學(xué)傳感器的構(gòu)建
[0012]①本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Hmiimers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀.稱(chēng)取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。
[0013]②將經(jīng)步驟①制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過(guò)打磨并超聲清洗過(guò)的玻碳電極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。
[0014]③將步驟②所制備的被ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液，在-〇.4V電勢(shì)下電沉積300s，會(huì)在電極表面形成一層光亮的金膜。[〇〇15]④將經(jīng)步驟③氧化還原后的電極用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面的進(jìn)一步增長(zhǎng)，并用氮?dú)獯蹈?，放置備用。[〇〇16] ⑤在經(jīng)步驟④處理的電極表面滴加5yL端氨基修飾的探針DNA(lOyM)和10yL Tris-HCl緩沖完成電極的修飾。然后用Tris-HCl緩沖液(含20mM的NaCl溶液)和超純水緩緩清洗，去除未結(jié)合的探針DNA和雜質(zhì)，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆?，完成傳感器的制備?br>【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于石墨烯和金納米粒子修飾的玻碳電極，其特征在于顯著增強(qiáng)了玻碳電極的 電化學(xué)性能。2.—種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其特征在于實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的快速、靈敏的檢 測(cè)。3.權(quán)利要求1所述的基于石墨稀和金納米粒子修飾的玻碳電極，其制備方法為:(1)ERGO修飾玻碳電極稱(chēng)取制備完成的氧化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然 后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液，用移液槍取15此滴加在預(yù)處理 完成的玻碳電極表面，電極垂直倒置，室溫中自然晾干，之后用蒸餾水緩緩沖洗后放置在 0.1MPBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃描范圍-1.7V—0V，掃速50mV/s)，至峰形及峰電流 值穩(wěn)定不變?yōu)橹?，完成氧化石墨稀的電還原，至此，得到ERGO修飾的玻碳電極。(2)AuNPs的電沉積將ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸溶液中，氯金酸溶液以 0.5M的硫酸溶液為溶劑配制，在-0.4V的電壓下電沉積300s，可以在電極表面形成一層致密 的金膜，電沉積完成后，立即將電極取出用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面 的進(jìn)一步增長(zhǎng)，最后用氮?dú)獯蹈?，放置備用?.權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其制備方法為:(1)本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Hummers，成功合成了高質(zhì)量的氧化石墨稀，稱(chēng)取制備完成的氧 化石墨烯粉末2.0g溶解于lml超純水中，配制成2.0g/ml的溶液，然后于超聲清洗機(jī)中進(jìn)行 超聲剝離60min，得到深棕色懸濁液。(2)將經(jīng)步驟(1)制備完成的氧化石墨烯溶液滴加在經(jīng)過(guò)打磨并超聲清洗過(guò)的玻碳電 極表面，并且在在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，完成氧化石墨烯的電還原。(3)將步驟(2)所制備的被ERGO修飾的玻碳電極用蒸餾水沖洗后放置在5.0mM的氯金酸 溶液，在-0.4V電勢(shì)下電沉積300s，會(huì)在電極表面形成一層光亮的金膜。(4)將經(jīng)步驟(3)氧化還原后的電極用蒸餾水沖洗2min，以防止金納米粒子在電極表面 的進(jìn)一步增長(zhǎng)，并用氮?dú)獯蹈?，放置備用?5)在經(jīng)步驟(4)處理的電極表面滴加5yL端氨基修飾的探針DNA(lOyM)和10yL Tris-HC1緩沖完成電極的修飾，然后用Tr i s-HCl緩沖液(含20mM的NaCl溶液)和超純水緩緩清洗， 去除未結(jié)合的探針DNA和雜質(zhì)，最后用氮?dú)獯蹈蓚溆?，完成傳感器的制備?.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其特征在于利用氧化的 石墨烯和金納米粒子的協(xié)同作用對(duì)電信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)，提高大腸桿菌電化學(xué)檢測(cè)的靈敏度和 檢測(cè)限。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)傳感器，其用途在于能夠快速，準(zhǔn) 確的對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK106093171SQ201610361791
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】許世超, 溫俊男, 張憶, 張憶一
【申請(qǐng)人】天津工業(yè)大學(xué)