專利名稱：：一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁
技術領域：
，尤其涉及一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法。
背景技術：
：浙貝母(Frj'"'"arj'a^朋&2^77Miq.)是百合科貝母屬植物，其干燥鱗莖是著名中藥材"浙八味"之一，是化痰止咳、治療氣管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良藥。浙貝母原產(chǎn)象山縣，故又稱象貝母。據(jù)傳清康熙年間，象山農(nóng)民開始將貝母從野生轉(zhuǎn)入家種。一直以來，浙貝母以磐安、鄞州為主產(chǎn)地，約占全國浙貝母總產(chǎn)量的70%，江蘇、江西、上海、湖北和湖南省亦有栽培。隨著種植業(yè)結(jié)構調(diào)整的深入，近年來浙江省浙貝母的栽培面積迅速擴大。但在人工栽培中，浙貝母生產(chǎn)由于采用大鱗莖作種，其繁殖系數(shù)極低，約為1.61.8倍，用種量極大，用種500kg/畝，種子地下休眠期長，約4個月。浙貝母如此低的繁殖系數(shù)和如此高的耗種量，導致生產(chǎn)用地和留種地面積的增加及生產(chǎn)成本增加。同時，長期的營養(yǎng)繁殖導致浙貝母種質(zhì)嚴重退化，鱗莖產(chǎn)量和品質(zhì)下降，已成為嚴重地阻礙了浙貝母產(chǎn)業(yè)的發(fā)展的重要問題之一。近年來的研究揭示，植物病毒的侵染也是引起浙貝母種質(zhì)退化的主要原因之一。最近我們在浙江磐安縣田間對浙貝母進行調(diào)査發(fā)現(xiàn)，絕大部分植株均表現(xiàn)花葉和斑駁等典型的馬鈴薯Y病毒科成員侵染癥狀。通過對該病毒病原的普通生物學、血清學特征和基因組全序列的研究，結(jié)果表明存在二種新病毒的復合侵染，一種是浙貝母花葉病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus,TFMV)，另一種命名為貝母Y病毒(/^rj'^7Z32TvirusY，F(xiàn)VY)，該病毒病害普遍發(fā)生是引起浙貝母種質(zhì)嚴重退化的重要原因之一；同時提出以田間浙貝母上發(fā)生的病毒，經(jīng)擴增、克隆和原核表達制備成病毒特異性抗血清，對浙貝母植株樣品進行病毒ELISA檢測的方法(WeiCBetal.(2005)ArchivesofVirology,150:1271-1280;ChenJetal.(2006)ArchivesofVirology,151:439-447;韋傳寶等(2006).科技通報，22(4):506-509)。浙貝母莖尖脫毒組培培養(yǎng)研究到目前為止尚未見報道。因此建立浙貝母脫毒組培快繁技術體系，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無病毒種球，為真正實現(xiàn)GAP栽培和規(guī)?；a(chǎn)提供技術平臺，具有較大的應用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是，針對現(xiàn)有浙貝母常規(guī)生產(chǎn)繁種技術中采用大鱗莖作種，繁殖系數(shù)極低，用種量極大，種子地下休眠期長，生產(chǎn)和留種地面積大，并有植物病毒侵染，導致品質(zhì)差，產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高等缺陷；提供一種能大量、快速繁殖鱗莖，又能脫除鱗莖所帶病毒并經(jīng)特異檢測，以確保無毒的浙貝母鱗莖脫毒、組培與檢測的配套方法。本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法，按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基;鱗莖生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D0.51.5mg/L+ZTl3mg/L;3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BAl3mg/L+NAA13mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;4)壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.51.5mg/L+NAA0.51.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.llmg/L+NAA0.1lmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)鱗莖生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1lmg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖、嫩莖或花梗，經(jīng)滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養(yǎng)將外植體材料在無菌條件下，切成0.30.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養(yǎng)將誘導形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；④壯苗培養(yǎng)將增殖的子鱗莖在4。C低溫、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理l周，然后在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天長成苗高57cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35'C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理24周后，供莖尖培養(yǎng)用；⑥莖尖培養(yǎng):將熱處理后的組培壯苗在40倍雙筒解剖鏡下，摘出0.20.5mm長帶12個葉原基的莖尖作為脫毒培養(yǎng)的外植體；2)子鱗莖誘導培養(yǎng)將外植體莖尖接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養(yǎng)將子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；根據(jù)對子鱗莖數(shù)量的需求，每隔3045天按同樣方法進行子鱗莖再增殖；4)子鱗莖生長培養(yǎng)將子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天，使鱗莖長大到O.5lcm;5)生根培養(yǎng):將長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出35根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至57cm以上、根長出5根以上時，移栽基質(zhì)培養(yǎng)12個月至成苗。(3)、病毒ELISA檢測將田間病株所攜帶的浙貝母花葉病毒(/riz^7h/ymosaicVirus,TFMV)和貝母Y病毒(尸r"j7Zg2yvirusY，F(xiàn)VY)，經(jīng)擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清后，對浙貝母脫毒組培鱗莖進行病毒ELISA檢測。所述的培養(yǎng)基配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基；鱗莖生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;(4)壯苗培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基白糖40g/L的MS十BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;(6)生根培養(yǎng)基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB:)4mg/L。所述的滅菌處理是將外植體的材料經(jīng)75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.升汞水溶液浸泡1015min，最后用無菌水沖洗35次。所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照光強為20003000Lx，光照時間為12h/d。所述的移栽基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:1配制而成。本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明在探明造成浙貝母種球退化的原因，系由浙貝母花葉病毒(f力〃/z6er^/rj'"7Jar7mosaicVirus,TFMV)禾口貝母Y病毒(Frj'fJZsiyvirusY，F(xiàn)VY)混合感染致使發(fā)病的基礎上，建立的浙貝母病毒(TFMV和FVY)外殼蛋白基因RT-PCR擴增、克隆、原核表達及高靈敏度ELISA檢測體系，通過該檢測技術應用，可保證脫毒子鱗莖中無病毒存在，為進一歩控制病毒病發(fā)生傳播，浙貝母品種提純復壯奠定了基礎；2)建立的浙貝母脫毒組培快繁技術體系，脫毒效果好，鱗莖增殖快，其月增殖率可達4.5倍，其生根率達100%,移栽成活率達95%以上，適合工廠化育苗，可商品化生產(chǎn)，從而大大節(jié)省了傳統(tǒng)方法的繁種用地，顯著降低了浙貝母的生產(chǎn)成本；3)脫毒鱗莖可比常規(guī)未脫毒鱗莖增產(chǎn)1020%，按畝產(chǎn)量1000Kg計算，每畝可增產(chǎn)100200Kg，并顯著提高了浙貝母的產(chǎn)品質(zhì)量。具體實施方式通過以下實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。2，4-D:2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid)，美國進口國內(nèi)分裝，分析純，純度99.5%。ZT:玉米素(Zeatin)，美國進口國內(nèi)分裝，分析純，純度99%。BA:6-節(jié)氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，美國進口國內(nèi)分裝，分析純，純度99.9%。NAA:a-萘乙酸(l-Naphthylaceticacid)，美國進口國內(nèi)分裝，分析純，純度99.5%。鹽酸硫胺素(VBt):美國進口國內(nèi)分裝，分析純，純度99%。水解酪蛋白(CH):sigma公司進口，分析純。實施例1:一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法，按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基;鱗莖生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;4)壯苗培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素眞)4mg/L;5)鱗莖生長培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)生根培養(yǎng)基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(跳)4mg/U(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖，經(jīng)75%酒精浸泡0.8min，再用0.1%升汞水溶液浸泡13min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養(yǎng)將外植體材料在無菌條件下，切成0.30.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在溫度23士2。C，光強2500Lx，光照時間12h/d的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養(yǎng)將誘導形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；④壯苗培養(yǎng)將增殖的子鱗莖在4。C低溫、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理1周后，在與步驟(2)-1)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天長成苗高57cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35'C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理3周后，供莖尖培養(yǎng)用；⑥莖尖培養(yǎng):將熱處理后的組培壯苗在40倍雙筒解剖鏡下，摘出0.20.5mm長帶12個葉原基的莖尖作為脫毒培養(yǎng)的外植體；2)子鱗莖誘導培養(yǎng)將莖尖外植體接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養(yǎng)將子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在與步驟(2)-l)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天增殖出子鱗莖；根據(jù)對子鱗莖數(shù)量的需求，每隔3045天按同樣方法進行子鱗莖的再增殖；4)子鱗莖生長培養(yǎng)將增殖出的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3045天，使鱗莖長大到0.5lcm;5)生根培養(yǎng)將長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數(shù)根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至35cm、根長出5根以上時，移栽到由泥炭珍珠巖蛭石按體積l:2:l配制而成的基質(zhì)中，培養(yǎng)12個月至成苗。(3)病毒ELISA檢測1)、浙貝母病毒病原種類的鑒定①取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存?zhèn)溆?；②電鏡觀察取病汁液經(jīng)負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)；③病毒種類RT-PCR檢測和鑒定對侵染浙貝母2種病毒的序列分別合成擴增各種病毒外殼蛋白基因的引物；以植物總RNA為模板，逆向引物(_)合成病毒第一鏈cDNA，進而以此cDNA為模板，采用TaKaRa公司LATaqTMPCR體系或￡T7agDNA聚合酶體系，對各種病毒逐一進行RT-PCR檢測；2)病毒ELISA檢測由于浙貝母通常含有本發(fā)明人鑒定明確的浙貝母花葉病毒(r力^2^T^/rWWafymosaicVirus,TFMV)禾口貝母Y病毒OW"War"irusY,FVY)2種病毒，而這2種病毒又難以分離純化，從而將上述2種病毒外殼蛋白基因，經(jīng)擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清，作為浙貝母脫毒組培鱗莖的病毒ELISA檢測之用。實施例2:本例中，其基本培養(yǎng)基的瓊脂為9g/L，pH為5.6;子鱗莖誘導培養(yǎng)基為蔗糖20g/L的MS+2，4-DO.5mg/L+ZTlmg/L;子鱗莖增殖培養(yǎng)基為白糖30g/L的MS十BAlmg/L+NAA3mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;壯苗培養(yǎng)基為白糖20g/L的MS+BA1.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鱗莖生長培養(yǎng)基為白糖20g/L的MS+BA0.lmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBt)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培養(yǎng)基為白糖30g/L的1/2MS+NAA0.lmg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;取浙貝母新生長的嫩莖，經(jīng)75%酒精浸泡0.5min，再用0.1%升汞水溶液浸泡10min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料;將壯苗在35°C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下進行處理熱2周后，供莖尖培養(yǎng)用；以溫度23土2°C，光強2000Lx，光照時間12h/d為培養(yǎng)條件；其余步驟，條件均同于實施例1。實施例3:本例中，其基本培養(yǎng)基的瓊脂為8g/L，pH為5.7;子鱗莖誘導培養(yǎng)基為蔗糖40g/L的MS+2，4-D1.5mg/L+ZT3mg/L;子鱗莖增殖培養(yǎng)基為白糖20g/L的MS十BA3mg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;壯苗培養(yǎng)基為白糖30g/L的MS+BA0.5mg/L和NAAL5mg/L+鹽酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鱗莖生長培養(yǎng)基為白糖30g/L的MS+BAlmg/L+NAA0.lmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培養(yǎng)基為白糖40g/L的1/2MS+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;取浙貝母新生長的花梗，經(jīng)75%酒精浸泡1.0min，再用0.1%升汞水溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；將壯苗在35。C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下進行熱處理4周后，供莖尖培養(yǎng)用；以溫度23士2°C，光強3000Lx，光照時間12h/d為培養(yǎng)條件；其余步驟，工藝、條件均同于實施例1。試驗例(病毒檢測)1、對照材料從田間采集的浙貝母病葉鱗莖為材料。2、處理材料以實施例l、2或3獲得的脫毒組培鱗莖為材料。3、病毒ELISA檢測由于浙貝母常含有2種病毒復合侵染，通常病毒難以分離純化，從而應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。4、檢測結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求1、一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法，其特征在于按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基；鱗莖生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D0.5～1.5mg/L+ZT1～3mg/L；3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基MS+BA1～3mg/L+NAA1～3mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；5)鱗莖生長培養(yǎng)基MS+BA0.1～1mg/L+NAA0.1～1mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；6)鱗莖生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～1mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖、嫩莖或花梗，經(jīng)滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養(yǎng)將外植體材料在無菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1～2個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養(yǎng)將誘導形成的子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；④壯苗培養(yǎng)將增殖的子鱗莖在4℃低溫、光強2000～3000Lx，光照時間12h/d下處理1周，然后在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天長成苗高5～7cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35℃、光強2000～3000Lx，光照時間12h/d下處理2～4周后，供莖尖培養(yǎng)用；⑥莖尖培養(yǎng)將熱處理后的組培壯苗在解剖鏡下，摘出0.2～0.5mm長帶1～2個葉原基的莖尖作為脫毒培養(yǎng)的外植體；2)子鱗莖誘導培養(yǎng)將外植體莖尖接種在子鱗莖誘導培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1～2個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養(yǎng)將子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天增殖出子鱗莖；根據(jù)對子鱗莖數(shù)量的需求，每隔30～45天按同樣方法進行子鱗莖再增殖；4)子鱗莖生長培養(yǎng)將子鱗莖轉(zhuǎn)接到子鱗莖生長培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天，使鱗莖長大到0.5～1cm；5)生根培養(yǎng)將長大的子鱗莖接種在生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出3～5根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至5～7cm以上、根長出5根以上時，移栽基質(zhì)培養(yǎng)1～2個月至成苗。(3)、病毒ELISA檢測將田間病株所攜帶的浙貝母花葉病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus，TFMV)和貝母Y病毒(FritillaryvirusY，F(xiàn)VY)，經(jīng)擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清后，對浙貝母脫毒組培鱗莖進行病毒ELISA檢測。2、按權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基；鱗莖生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;(2)子鱗莖誘導培養(yǎng)基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L;(4)壯苗培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素4mg/L;(5)鱗莖生長培養(yǎng)基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L禾口NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L;(6)生根培養(yǎng)基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L。3、按權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的滅菌處理是將外植體材料經(jīng)75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.1%升汞水溶液浸泡1015min，最后用無菌水沖洗35次。4、按權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的各脫毒組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為23士2。C，光照光強為20003000Lx，光照時間為12h/d。5、按權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的移栽基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:1配制而成。全文摘要本發(fā)明涉及一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法，屬植物種苗繁殖
技術領域：
，專用于浙貝母脫毒苗的繁殖與病毒的檢測。該方法包括培養(yǎng)基的配制；脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)；病毒ELISA檢測等步驟。具有脫毒效果好，病毒檢測靈敏度高，可保證脫毒子鱗莖中無病毒存在，有效控制了病毒病的發(fā)生與傳播；鱗莖增殖快，月增殖率可達4.5倍，適合工廠化育苗，大大節(jié)省了傳統(tǒng)方法的繁種用地，顯著降低了浙貝母的生產(chǎn)成本；可在浙貝母品種提純復壯與開發(fā)中推廣應用。文檔編號A01H4/00GK101213937SQ200710306829公開日2008年7月9日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權日2007年12月28日發(fā)明者呂永平,剛徐,林林,汪一婷,牟豪杰,曄程,鄭紅英,陳劍平申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院