專利名稱：長期貯藏梨花粉種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是長期貯藏梨花粉種質(zhì)的方法，屬于植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梨(Pyrus)屬于配子體型自交不親和性果樹，絕大多數(shù)品種自花授粉不結(jié)實，在 生產(chǎn)上必須配置授粉樹，或者進行人工授粉才能獲得預(yù)期的產(chǎn)量和品質(zhì)。但在生產(chǎn)上由 于花期不遇或者天氣原因，常常需要從外地采集、調(diào)用花粉，甚至需要用到前一年貯藏的花 粉；在梨育種工作中，根據(jù)育種目標的不同，育種者也常常要從各地調(diào)用具特殊或優(yōu)異性狀 的梨種質(zhì)花粉以豐富遺傳多樣性；此外，由于梨是典型的配子體型自交不親和性果樹，梨花 粉在自交不親和性機理的研究中常常作為重要的研究試材，但梨花粉一年只能采一次，這 必然涉及到在一年的研究周期中花粉的貯藏問題。不論從梨樹栽培、育種還是科學(xué)研究方 面來說，其工作基礎(chǔ)是花粉須具有較高的活力，具有較高活力的花粉是上述工作取得成功 的關(guān)鍵性前提條件。因此，怎樣在貯藏、運輸過程中延長花粉壽命，最大限度地維持花粉活 力對梨樹生產(chǎn)、種質(zhì)保存、科研具有重要意義。相關(guān)研究報道，花粉的活力受溫度和濕度的 影響，但尚未形成能夠較好維持梨花粉活力的有效貯藏方法。一般常溫下貯藏的梨花粉活 力迅速下降，失去應(yīng)用價值。本發(fā)明通過比較研究不同貯藏方法對梨花粉萌發(fā)和花粉管生 長的影響，形成包含三個關(guān)鍵技術(shù)步驟的梨花粉長期貯藏技術(shù)。該技術(shù)操作簡單易行，節(jié)省 空間，有效維持了長期貯藏后梨花粉的活力，在梨樹生產(chǎn)、育種、種質(zhì)保存、科學(xué)研究等方面 具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求本發(fā)明的目的在于解決梨花粉在常規(guī)貯藏過程中花粉活力急速降低，以致不能滿 足生產(chǎn)、科研需要的問題。技術(shù)方案本發(fā)明要解決上述問題所采用的新技術(shù)方案如下1、花粉采集方法采含苞待放的大蕾期花苞，帶回室內(nèi)，揉搓花朵，使花藥與花絲 分離，用細孔篩篩下花藥。雨后采花或花瓣沾有露時，先晾干再揉搓花朵?；ㄋ幵跍囟?0 25°C、相對濕度70% 80%、無陽光直射的室內(nèi)單層攤勻，經(jīng)1 2天后即可散出花粉。爆 出的花粉用石蠟紙分小包包好，每包5cmX5cmX0. 5cm大小，埋入放有變色硅膠的干燥容 器中，外用錫紙包扎整齊，以達到干燥遮光的目的；2、液氮凍存花粉根據(jù)所藏花粉量的多少來選擇大小合適的液氮罐，將包扎好的 花粉置于液氮罐內(nèi)，淹沒于液氮。為防止液氮揮發(fā)殆盡，貯藏期間內(nèi)每隔兩個月補充一次液 氮；3、花粉復(fù)蘇待需要使用花粉時，打開罐口，傾倒出罐內(nèi)的液氮，此時切忌立即將 包扎的花粉直接暴露于常溫環(huán)境中。因為升溫太快會導(dǎo)致花粉褐變，使得花粉蛋白酶性失活，大大降低花粉活力。應(yīng)將貯藏的花粉依次在-73°C、-20°C、4°C中分別放置24小時進行 逐步蘇醒，最后于黑暗環(huán)境中恢復(fù)至室溫，備用。有益效果本發(fā)明的貯藏方法有效地維持了經(jīng)長期貯藏的梨花粉活力，對于梨樹的生產(chǎn)、育 種、種質(zhì)保存、科學(xué)研究等方面具有重要的有益效果，具體表現(xiàn)如下(1)保障了人工授粉時采集、調(diào)運花粉過程中花粉的安全性，使生產(chǎn)中保存花粉以 備來年使用，保障花粉充足供應(yīng)成為可能；(2)為育種工作中所需的不同地域來源花粉的高活力保存提供技術(shù)支撐，同時為 通過花粉進行梨種質(zhì)保存提供了一條新的途徑；(3)可以周年為梨自交不親和性機理科學(xué)研究提供具高活力的梨花粉，克服了相 關(guān)研究的季節(jié)局限性；(4)本貯藏方法投資小，操作簡單，能在很小的空間里貯藏大量的花粉，并可借鑒 用于保存種子等其他種質(zhì)資源，有著廣泛的實用價值。
四

圖1 ‘豐水，梨花粉在_20°C、_73°C、_196°C三種貯藏環(huán)境下花粉活力的變化；圖2長期貯藏梨花粉的流程示意五具體實施例方式(一)實驗方法1、花粉采集本專利以‘豐水’梨為研究試材，采集含苞待放的大蕾期花苞，收集花 藥，室溫下干燥爆粉，待花粉散出后用石蠟紙包好，按不同的方法保存花粉，并定期進行檢 測；2、花粉保存方法(1)花粉貯藏溫度的梯度處理將同一包花粉分成五份，每份約5cmX5cmX0. 5cm 大小，埋入放有變色硅膠(一種顆粒狀干燥劑，藍色，吸水后變白)的干燥容器中，分別在室 溫、4°C、-20-73_196°C條件下貯藏。其中室溫下每隔5天，按上述花粉培養(yǎng)法測量 一次花粉萌發(fā)率和花粉管長度。4°C每隔10天測量一次，而-20°C、-73°C、-196°C條件下貯 藏的花粉將于貯藏之日起第30天、60天、90天、180天、270天、360天進行測定；(2)花粉貯藏濕度的梯度處理將采集的花粉用石蠟紙包好后置于空氣濕度 15 %、32 %、52 %、66 %、81 %的密閉盒子中，并將盒子置于黑暗、室溫條件下，分別貯存1、6、 12、18天后，按上述花粉培養(yǎng)與測量方法測定花粉萌發(fā)率和花粉管長度；3、花粉活力測定本研究采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉。培養(yǎng)基的組分為10%蔗糖、 0.01%硼酸和的瓊脂。將花粉均勻地點播在培養(yǎng)基上，在黑暗、25°C條件下培養(yǎng)24h。 在培養(yǎng)基上滴數(shù)滴甲基藍染色液，在顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)和生長情況。在統(tǒng)計花粉萌 發(fā)率時，以萌出的花粉管長度超過花粉粒直徑的為已發(fā)芽，否則為未發(fā)芽花粉，統(tǒng)計100粒 以上；花粉萌發(fā)率為已萌發(fā)的花粉數(shù)除以總觀測的花粉數(shù)乘以100%;花粉管生長長度測量 20條，計算其平均值。每個處理重復(fù)3次。( 二)結(jié)果與分析
1、不同貯藏溫度對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在不同貯藏溫度下貯藏的花粉萌發(fā)率和花粉管生長長度差異 顯著。室溫條件下，花粉活力下降很快，貯藏20天后萌發(fā)率從0天的98. 7%下降到4.3%， 貯藏30天后，花粉完全失去活力。但隨著貯藏溫度的降低，花粉保持活力的時間越來越長， 液氮凍存(_196°C )條件下，花粉貯藏360天后花粉的萌發(fā)率依然可達68. 9%且花粉管長 度仍較長，說明活力強(圖1)。2、貯藏濕度對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響在不同貯藏濕度下花粉萌發(fā)和花粉管生長存在很大差異(表1)，在高濕度條件下 花粉迅速失去活力，隨著濕度的降低，花粉維持活力的時間也越長，如相對濕度15%時，室 溫貯藏18天后，劃分萌發(fā)率仍然達到58. 2%，花粉管長度也較高適度條件下花粉管長。貯藏溫度和濕度和花粉活力保持時間呈負相關(guān)關(guān)系，說明低溫、低濕度有利于梨 花粉的長期保存，利于梨花粉活力的維持。根據(jù)以上結(jié)論提出本發(fā)明內(nèi)容(圖2)將梨花粉經(jīng)干燥后裝于變色硅膠盒內(nèi)，外 用錫紙包扎密封，進行液氮超低溫貯藏，待需要用時將貯藏的花粉依次在-73°C、-20°C、4°C 中分別放置24小時進行逐步蘇醒，最后于黑暗環(huán)境中恢復(fù)至室溫，備用。該貯藏方法保險 可靠，操作簡單易行且節(jié)省空間，解決了梨花粉在常規(guī)貯藏過程中花粉活力急速降低，以致 不能滿足生產(chǎn)、科研需要的問題。表1 ‘豐水’花粉在不同濕度貯藏后的萌發(fā)率和花粉管長度
權(quán)利要求
長期貯藏梨花粉的方法，包含1)花粉采集采含苞待放的大蕾期花苞，帶回室內(nèi)，揉搓花朵，使花藥與花絲分離，用孔徑1.43mm細孔篩篩下花藥，雨后采花或花瓣沾有露時，先晾干再揉搓花朵，花藥在溫度20～25℃、相對濕度體積比70％～80％、無陽光直射的室內(nèi)單層攤勻，經(jīng)1～2天后散出花粉，爆出的花粉用石蠟紙分小包包好，每包5cm×5cm×0.5cm大小，埋入放有變色硅膠的干燥容器中，盒用錫紙包扎整齊，以達到干燥遮光的目的；2)液氮凍存花粉將包扎好的花粉置于液氮罐內(nèi)，淹沒于液氮，為防止液氮揮發(fā)殆盡，貯藏期間內(nèi)每隔兩個月補充一次液氮；3)花粉復(fù)蘇待需要使用花粉時，打開罐口，傾倒出罐內(nèi)的液氮，將貯藏的花粉依次在 73℃、 20℃、4℃中分別放置24小時進行逐步蘇醒，最后于黑暗環(huán)境中恢復(fù)至室溫，備用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種梨花粉長期可靠的貯藏方法，屬于植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域。將梨花粉經(jīng)干燥后裝于變色硅膠盒內(nèi)，外用錫紙包扎密封，進行液氮凍存超低溫貯藏，待來年需要用時將貯藏的花粉依次在-73℃、-20℃、4℃中分別放置24小時進行逐步蘇醒，最后于黑暗環(huán)境中恢復(fù)至室溫，備用。該方法保險可靠，可有效維持梨花粉的活力，操作簡單易行，節(jié)省空間，且可借鑒用于其他種質(zhì)資源的保存，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號A01F25/00GK101982046SQ20101025623
公開日2011年3月2日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰, 齊永杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)