本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及種一種提高千層塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)外植體表面滅菌效率的方法。

背景技術(shù)：
千層塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)為石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉屬(LycopodiumL.)多年生草本蕨類(lèi)植物。千層塔始載于《植物名實(shí)圖考》，性味辛苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1927年我國(guó)科技工作者報(bào)道了從該植物中分離的石杉?jí)A甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉?jí)A甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑。現(xiàn)在，被石杉?jí)A甲及經(jīng)作為治療阿爾茨海默病(AD，Alzheimerdisease)的藥物，同時(shí)在美國(guó)被用做益智的營(yíng)養(yǎng)保健品。但是，千層塔自然資源嚴(yán)重短缺。千層塔生長(zhǎng)緩慢，野生狀態(tài)下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長(zhǎng)，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6-15年才能成熟。因此極大地限制了千層塔野生資源的再生。千層塔中的石杉?jí)A甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉?jí)A甲步驟繁瑣、價(jià)格昂貴且有副作用。目前，石杉?jí)A甲的提取主要依賴(lài)于野生資源，提取率僅為0.006％-0.1％，因而大量的市場(chǎng)需求、受限的自然資源和自身生長(zhǎng)繁殖的限制。因此，不論是石杉?jí)A甲直接或者間接獲得都是以千層塔的原植物為原料，這種自然界有限的資源將處于滅絕的邊緣。利用植物組織培養(yǎng)可進(jìn)行珍稀和瀕危藥用植物的微繁殖，建立高效和穩(wěn)定培養(yǎng)系，培育出脫毒的優(yōu)質(zhì)品種，解決珍稀瀕危藥用植物人工種植存在的種子稀少、種苗奇缺、種質(zhì)退化等嚴(yán)重問(wèn)題，為千層塔的資源再生和可持續(xù)利用提供技術(shù)手段。但是，千層塔組織培養(yǎng)過(guò)程主要采用的是葉片、莖和根。這些外植體存在外植體滅菌困難、無(wú)菌外植體獲得率低，而且滅菌后大部分死亡，不能生長(zhǎng)、分化和增殖等問(wèn)題。因此，對(duì)于千層塔的組織培養(yǎng)，外植體的滅菌至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，該方法能夠顯著千層塔外植體表面的滅菌效率，同時(shí)提高了千層塔外植體的存活率。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：一種提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，該方法包括在低壓環(huán)境中將千層塔外植體采用滅菌劑進(jìn)行滅菌，滅菌后的千層塔外植體在低壓環(huán)境中培養(yǎng)。具體的，所述的低壓環(huán)境是指壓力為40～60KP。更具體的，所述的千層塔外植體指千層塔的根、千層塔的莖或千層塔的葉。進(jìn)一步的，千層塔外植體采用滅菌劑進(jìn)行滅菌包括：取千層塔外植體依次經(jīng)流水沖洗、體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇溶液浸泡、體積分?jǐn)?shù)為5％的NaOCl溶液浸泡及體積分?jǐn)?shù)為7％的過(guò)氧化氫溶液浸泡，千層塔外植體經(jīng)NaOCl溶液和過(guò)氧化氫溶液浸泡時(shí)處于低壓環(huán)境。具體的，千層塔外植體在NaOCl溶液中浸泡的低壓環(huán)境時(shí)間為5～15min，千層塔外植體在過(guò)氧化氫溶液中浸泡的低壓環(huán)境時(shí)間為5～10min。另外，將經(jīng)過(guò)滅菌劑滅菌處理的千層塔外植體轉(zhuǎn)接到MS固體培養(yǎng)基上于低壓環(huán)境中培養(yǎng)，2周后取出千層塔外植體轉(zhuǎn)移到常壓培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。還有，低壓環(huán)境中培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000Lux，低壓環(huán)境中培養(yǎng)的光周期為16h；在常壓培養(yǎng)室中的培養(yǎng)的溫度為25℃。進(jìn)一步的，在所述的MS固體培養(yǎng)基中添加100～200mg/L的兩性霉素B。優(yōu)選的，所述的低壓環(huán)境中培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為30～40℃。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：(1)本發(fā)明通過(guò)低壓結(jié)合溫和的滅菌劑處理，以及滅菌后的低壓和高溫培養(yǎng)，不僅提高了千層塔外植體的滅菌效率，同時(shí)還提高了千層塔的移栽成活率，可用于千層塔的組織培養(yǎng)，為千層塔的滅菌培養(yǎng)提供了新思路；(2)對(duì)千層塔外植體滅菌，最好的方案是：滅菌時(shí)，5％NaOCl浸泡時(shí)間為10分鐘，7％過(guò)氧化氫浸泡時(shí)間為8分鐘，兩種滅菌劑浸泡時(shí)的壓力為50KP；滅菌后前兩周培養(yǎng)時(shí)，MS固體培養(yǎng)基中含有的兩性霉素B的濃度為150mg/L，培養(yǎng)的壓力為50KP，培養(yǎng)的溫度為35℃。兩周后進(jìn)行正常的培養(yǎng)。在這樣的條件下，千層塔的葉片除菌率和存活率分別達(dá)到60％和75％；千層塔的莖除菌率和存活率達(dá)到55％和78％；千層塔的根除菌率和存活率分別達(dá)到55％和58％。具體實(shí)施方式千層塔在人工組織培養(yǎng)中遇到的最大的問(wèn)題就是外植體污染嚴(yán)重。如果滅菌時(shí)間不夠，則滅菌效率極低；如果滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則外植體成活率極低。嚴(yán)重阻礙了千層塔組織培養(yǎng)的成功。本發(fā)明的提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，通過(guò)低壓結(jié)合溫和的滅菌劑處理，以及滅菌后的低壓和高溫培養(yǎng)，不僅提高...