本發(fā)明屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高粱品種資源創(chuàng)新不足是目前高粱育種中面臨的最大問題，創(chuàng)造具有豐富遺傳基礎(chǔ)的資源材料是高粱育種工作者研究的重點(diǎn)之一。實(shí)踐證明，育種新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用對高粱育種材料的創(chuàng)新是非常重要的。生物技術(shù)是世界新技術(shù)革命的主要內(nèi)容之一，為培育高產(chǎn)、多抗、優(yōu)良的農(nóng)作物新品種提供了科學(xué)的手段。

近年來,植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)作為植物生物技術(shù)的組成部分被應(yīng)用于作物育種后,取得了一系列重大進(jìn)展與突破,在作物品種改良上發(fā)揮了很大的作用。與植物組織培養(yǎng)相比,植物細(xì)胞培養(yǎng)屬技術(shù)層次更高的培養(yǎng)技術(shù),它是指以離體的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)為外植體，在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，增殖形成新的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)再分化形成完整植株的技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)具有群體數(shù)量大、誘變率高、易于篩選等優(yōu)點(diǎn),不僅可以應(yīng)用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交，基因轉(zhuǎn)移和生產(chǎn)次生代謝物等，還可以在細(xì)胞水平上短期篩選出預(yù)期突變體，為作物品種改良提供了一種新途徑。很多植物的體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已獲得成功，其在作物育種方面的應(yīng)用也很廣泛。

在禾谷類作物中，對水稻、玉米、小麥、大麥等作物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究較多，并已得到原生質(zhì)體再生植株，其中對水稻的研究比較深入，不僅進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化和突變體的篩選，還培育出了新品種。但是，目前尚沒有一種比較成熟的高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，影響了高粱育種工作的開展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法及應(yīng)用，愈傷誘導(dǎo)率高，建立的細(xì)胞懸浮系不褐化，容易觀察，且懸浮細(xì)胞系中游離細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞分裂生長旺盛，在高粱育種方面具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供的一種高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇浸泡1-3min，再用無菌水沖洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10-20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗，得到無菌高粱種子；

步驟2，制備高粱愈傷組織；

步驟3，高粱體細(xì)胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，接種比例為2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培養(yǎng)，每隔7天繼代一次；每次繼代時，將新、舊液體培養(yǎng)基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)42-45天后獲得高粱體細(xì)胞懸浮系；

所述液體培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D和30g的蔗糖，pH為5.8。

優(yōu)選的，步驟1中，高粱種子先用70％乙醇浸泡1min后，再用無菌水沖洗2-3次；HgCl₂水溶液浸泡15min后，用無菌水沖洗5-6次。

優(yōu)選的，步驟2中，制備高粱愈傷組織，具體包括：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中，于25±1℃培養(yǎng)，每天光照12h；培養(yǎng)到高粱無菌苗苗長為3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)溫度為25±1℃，自然光照，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，均為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8。

優(yōu)選的，步驟2中，所述繼代培養(yǎng)的次數(shù)為2-3次，每次間隔18-25天。

優(yōu)選的，步驟3中，接種比例為2.5g:100mL。

本發(fā)明還提供了一種高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法在高粱育種中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具備以下有益效果：

(1)高粱無菌苗葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷，誘導(dǎo)率高，誘導(dǎo)出的愈傷經(jīng)過2-3次繼代后，可以得到較多的Ⅲ型胚性愈傷，這樣的愈傷適合用于懸浮培養(yǎng)的起始材料，并在后續(xù)的培養(yǎng)中容易建立細(xì)胞懸浮系，并且懸浮液不褐化。而從高粱幼穗培養(yǎng)得到的愈傷進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時，懸浮液很容易褐化，很難在倒置顯微鏡下跟蹤觀察及計(jì)數(shù)。

(2)本發(fā)明建立的穩(wěn)定優(yōu)良的懸浮細(xì)胞系，細(xì)胞密度大(為6.45×10⁵-5.08×10⁶個/mL)，游離細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)濃厚，近圓形細(xì)胞(圓形細(xì)胞、橢圓形細(xì)胞、腎形細(xì)胞)比例達(dá)70％以上，活細(xì)胞率達(dá)60％以上，細(xì)胞分裂生長旺盛。

附圖說明

圖1為三種類型愈傷組織結(jié)構(gòu)圖；

圖1中，a為Ⅰ型高粱愈傷組織；b為Ⅱ型高粱愈傷組織；圖1中c和d均為Ⅲ型高粱愈傷組織；

圖2為制備細(xì)胞懸浮系時，不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞顯微視圖；

圖2中，a圖為Ⅲ型愈傷組織培養(yǎng)一周后的細(xì)胞形態(tài)16×4倍放大圖，b圖為Ⅲ型愈傷組織培養(yǎng)一周后的細(xì)胞形態(tài)16×25倍放大圖，c圖為Ⅲ型愈傷組織第3次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×10倍放大圖，d圖為Ⅲ型愈傷組織第4次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×10倍放大圖，e圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×4倍放大圖，f圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養(yǎng)后經(jīng)伊文斯藍(lán)染色后的細(xì)胞形態(tài)16×25倍放大圖。

具體實(shí)施方式

下面對發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明提供的一種高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，將高粱無菌苗葉片培養(yǎng)獲得愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得高粱體細(xì)胞懸浮系，具體包括以下步驟：

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分?jǐn)?shù))浸泡滅菌1-3min，再用無菌水沖洗2-3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌10-20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5-6次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進(jìn)行攪拌處理。

需要說明的是，上述浸泡過程中浸泡液(70％乙醇或者HgCl₂水溶液)漫過種子上表面即可，以達(dá)到節(jié)約實(shí)際用量的目的。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養(yǎng)，每天光照12h；培養(yǎng)到高粱無菌苗苗長為3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)2-3次，每次間隔18-25天，培養(yǎng)條件同愈傷培養(yǎng)(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，均為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細(xì)胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養(yǎng)基的比例)為2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培養(yǎng)，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養(yǎng)基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)42-45天后獲得高粱體細(xì)胞懸浮系；

所述液體培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

需要說明的是，步驟3中，新液體培養(yǎng)基是指新配置且尚未使用的液體培養(yǎng)基；舊液體培養(yǎng)基指的是繼代培養(yǎng)高粱愈傷組織以后的培養(yǎng)基；以上一代培養(yǎng)后的留下的液體為舊液體培養(yǎng)基，然后加入新的培養(yǎng)基，混合后作為下一代的培養(yǎng)基，這個與本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)理解是相同的。

優(yōu)選的，本發(fā)明高粱體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，還包括以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

步驟1，高粱種子的處理(所述高粱種子的基因型為R111)：

高粱種子先用70％乙醇(體積分?jǐn)?shù))浸泡滅菌1min，再用無菌水沖洗2次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌15min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進(jìn)行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養(yǎng)，每天光照12h；培養(yǎng)到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)2次，每次間隔18天，培養(yǎng)條件同愈傷培養(yǎng)(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，均為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細(xì)胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織，用鑷子夾碎成小顆粒狀，接種于液體培養(yǎng)基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養(yǎng)基的比例)為2.5g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，25±1℃、自然光下培養(yǎng)，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養(yǎng)基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)42-45天后獲得高粱體細(xì)胞懸浮系；

所述液體培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH為5.8。

實(shí)施例2

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分?jǐn)?shù))浸泡滅菌3min，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌10min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗6次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進(jìn)行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養(yǎng)，每天光照12h；培養(yǎng)到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)2次，每次間隔25天，培養(yǎng)條件同愈傷培養(yǎng)(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，均為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細(xì)胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養(yǎng)基的比例)為2g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，25±1℃、自然光下培養(yǎng)，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養(yǎng)基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)42-45天后獲得高粱體細(xì)胞懸浮系；

所述液體培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

實(shí)施例3

步驟1，高粱種子的處理：

高粱種子先用70％乙醇(體積分?jǐn)?shù))浸泡滅菌2min，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡滅菌20min，HgCl₂水溶液浸泡過程中加入2滴吐溫-20，最后無菌水沖洗5次，得到無菌高粱種子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡時，均進(jìn)行攪拌處理。

步驟2，制備高粱愈傷組織：

將無菌高粱種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中，接種時注意高粱種子胚朝上，于25±1℃培養(yǎng)，每天光照12h；培養(yǎng)到高粱無菌苗苗長3-5cm時取出，將距離葉基1.0cm以上的葉片切成寬度為1mm的葉段，并將葉段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±1℃下培養(yǎng)愈傷，自然光照，20-30天后挑選狀態(tài)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)2次，每次間隔22天，培養(yǎng)條件同愈傷組織培養(yǎng)(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱顆粒狀愈傷組織；

所述無菌苗培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，均為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的瓊脂，pH為5.8；

步驟3，高粱體細(xì)胞懸浮系的建立：

選取步驟2中疏松、干燥、易碎、生長旺盛、顆粒狀的高粱愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，接種比例(高粱顆粒狀愈傷組織與液體培養(yǎng)基的比例)為3g:100mL，每個處理接種兩瓶，置于100r/min的搖床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，25±1℃、自然光下培養(yǎng)，每隔7天繼代一次，每次繼代時，將新、舊液體培養(yǎng)基以體積比為2：1的比例混合后作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)42-45天后獲得高粱體細(xì)胞懸浮系；

所述液體培養(yǎng)基為：每升MS培養(yǎng)基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

下面以實(shí)施例1的方法為例，對高粱體細(xì)胞懸浮系構(gòu)建過程中的愈傷組織生長狀況、細(xì)胞密度等進(jìn)行說明，具體包括：

以基因型R111的高粱種子滅菌后制備高粱愈傷組織，R111幼苗苗葉的愈傷誘導(dǎo)率為80-85％，有三種類型愈傷組織，如圖1所示，圖1中a為Ⅰ型高粱愈傷組織結(jié)構(gòu)圖，為白色或淺褐色半透明愈傷，柔軟，含水量很高，水漬狀，分泌粘液；圖1中b為Ⅱ型高粱愈傷組織結(jié)構(gòu)圖，愈傷白色或淺綠色，含水量較Ⅰ型少，形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)松散；圖1中c和d均為Ⅲ型高粱愈傷組織結(jié)構(gòu)圖，愈傷白色或淺綠色，干燥，表面顆粒狀，結(jié)構(gòu)較疏松。Ⅲ型高粱愈傷組織的顆粒狀愈傷脫分化程度和胚性高，適于作細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。經(jīng)過2-3次的繼代，可以得到許多Ⅲ型顆粒狀的愈傷組織。繼代時應(yīng)注意將不同類型的愈傷分離開，并保持其原有極性，這樣有利于快速獲得Ⅲ型顆粒狀的愈傷組織。

以上述Ⅲ型愈傷組織為材料，制備細(xì)胞懸浮系，不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞顯微視圖如圖2所示，a圖為Ⅲ型愈傷組織培養(yǎng)一周后的細(xì)胞形態(tài)16×4倍放大圖，b圖為Ⅲ型愈傷組織培養(yǎng)一周后的細(xì)胞形態(tài)16×25倍放大圖，該時期的懸浮細(xì)胞系由游離單細(xì)胞和多細(xì)胞團(tuán)組成，大小形狀極不均一，多屬薄壁細(xì)胞，破碎和質(zhì)壁分離普遍存在，活細(xì)胞率較低，細(xì)胞內(nèi)容物少，分裂能力弱，細(xì)胞團(tuán)由幾個到幾十個不等的細(xì)胞組成。

圖2中c圖為Ⅲ型愈傷組織第3次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×10倍放大圖，d圖為Ⅲ型愈傷組織第4次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×10倍放大圖，經(jīng)過連續(xù)3-4次的繼代培養(yǎng)，細(xì)胞形狀開始轉(zhuǎn)為近圓形細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加。

圖2中e圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)16×4倍放大圖，f圖Ⅲ型愈傷組織第6次繼代培養(yǎng)后經(jīng)伊文斯藍(lán)染色后的細(xì)胞形態(tài)16×25倍放大圖，該時期游離細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)濃厚，血球計(jì)數(shù)板檢測顯示細(xì)胞密度為6.45×10⁵-5.08×10⁶個/mL，伊文斯藍(lán)檢測顯示活細(xì)胞率為60.87-75％，近圓形細(xì)胞(圓形細(xì)胞、橢圓形細(xì)胞、腎形細(xì)胞)率為77.13-83.96％，細(xì)胞分裂生長旺盛，至此建立起一個良好的液體細(xì)胞懸浮系，可以用于高粱育種的研究。

所述活細(xì)胞率的檢測方法為：取懸浮細(xì)胞液一滴于載玻片中間，滴一滴0.05％伊文斯藍(lán)染色液染色，置于倒置顯微鏡下觀察，活細(xì)胞無色或僅有液泡呈淡淡的藍(lán)色，死細(xì)胞核被染成藍(lán)色或整個原生質(zhì)呈藍(lán)色。顯微鏡下計(jì)數(shù)10個視野的懸浮細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞的比例，活細(xì)胞率計(jì)算公式為：活細(xì)胞率(％)＝(活細(xì)胞總數(shù)/懸浮細(xì)胞總數(shù))×100％。

所述近圓細(xì)胞為圓形細(xì)胞、橢圓形細(xì)胞或者腎形細(xì)胞，檢測方法為計(jì)數(shù)完活細(xì)胞后，同時計(jì)數(shù)近圓形細(xì)胞，近圓細(xì)胞率的計(jì)算公式為：近圓細(xì)胞率(％)＝(近圓細(xì)胞總數(shù)/懸浮細(xì)胞總數(shù))×100％；

所述細(xì)胞密度的測定方法為：取1ml懸浮細(xì)胞液，將其稀釋3-5倍后，取1ml稀釋的懸浮細(xì)胞液加入1ml伊文斯藍(lán)染色液染色，滴于血球計(jì)數(shù)板上，蓋玻片壓片后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，取四周大格為計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)算細(xì)胞密度，細(xì)胞密度的計(jì)算公式為：細(xì)胞密度(個/mL)＝四周大格的細(xì)胞數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)×10×2。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。