本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，尤其涉及一種拳參的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、拳參（polygonum?bistorta?l.），屬于蓼科蓼屬多年生草本。拳參的干燥根莖作為中藥，具有清熱解毒、消腫止血的功效。拳參的花期為6-7月，總狀花序呈穗狀，花色粉或白，可供觀賞，亦可做地栽、干花欣賞。

2、因拳參的多種用途，為加快該品種的規(guī)模化生產(chǎn)，需要建立拳參的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，為該品種的進一步開發(fā)和利用提供有效的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種拳參的組織培養(yǎng)方法。

2、具體地，本發(fā)明提供以下所述的技術(shù)方案。

3、本發(fā)明提供一種拳參的組織培養(yǎng)方法，所述方法包括：以拳參帶有莖生葉處的莖段作為外植體，依次進行誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)、不定芽增殖和誘導(dǎo)不定芽生根；

4、其中，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基中包括如下植物激素組分：6-ba（6-芐氨基腺嘌呤）?1.0-2.0mg/l，naa（萘乙酸）?0.2-0.4mg/l；

5、不定芽增殖使用的培養(yǎng)基中包括如下植物激素組分：6-ba?2.0-3.0mg/l，tdz（噻苯?。?0.5-1.0mg/l。

6、選擇合適的外植體對于組織培養(yǎng)的最終結(jié)果和效率具有重要影響。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，對于拳參，以帶有莖生葉處的莖段作為外植體進行組織培養(yǎng)，能夠顯著提高誘導(dǎo)成功率，與采用葉片等部位作為外植體相比具有明顯優(yōu)勢。

7、以上所述的帶有莖生葉處的莖段優(yōu)選來源于生長健壯且無病蟲害的拳參母株。

8、針對上述外植體的選擇，本發(fā)明優(yōu)化了組織培養(yǎng)各步驟所使用的培養(yǎng)基中添加的激素組分。對于誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，同時添加上述特定濃度的6-ba和naa，兩種激素能夠配合作用，顯著提高芽點萌發(fā)的誘導(dǎo)率，同時縮短誘導(dǎo)所需時間，并且有利于不定芽增殖階段增殖系數(shù)的提高。對于不定芽增殖使用的培養(yǎng)基，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，上述特定濃度的6-ba和tdz能夠較好地配合作用，共同提高不定芽的增殖系數(shù)。

9、對于誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基，優(yōu)選不添加植物激素。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在上述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)和不定芽增殖階段的合適培養(yǎng)基下誘導(dǎo)出的叢生芽植株健壯，在誘導(dǎo)其生根階段，生根培養(yǎng)基中不添加植物激素即能夠獲得100%生根率，能夠減少激素對后續(xù)組培苗移栽成活率的影響。當(dāng)然，若不考慮植物激素成本以及在生根階段添加激素對后續(xù)組培苗移栽成活率可能帶來的不利影響，誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基中也可添加植物激素，例如添加iba，添加濃度為大于0且小于等于0.2?mg/l。

10、對于上述培養(yǎng)基，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基、不定芽增殖使用的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基中均還包括糖和瓊脂。

11、其中，誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基中還包括活性炭。活性炭能夠吸附不定芽的代謝產(chǎn)物，增強培養(yǎng)基的通透性。

12、優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：6-ba?1.0-2.0mg/l，naa?0.2-0.4mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

13、優(yōu)選地，所述不定芽增殖使用的培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：6-ba?2.0-3.0mg/l，tdz?0.5-1.0mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

14、采用上述特定的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)培養(yǎng)階段和不定芽增殖培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基，能夠使得兩個培養(yǎng)階段很好地銜接和配合作用，有效提高不定芽的分化情況，同時提高不定芽的增殖效率。其中，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)的培養(yǎng)基中，6-ba和naa作為誘導(dǎo)激素配合作用，能夠更好地促進細胞的增殖和擴大，誘導(dǎo)外植體脫分化和不定芽萌發(fā)。與單獨采用naa的誘導(dǎo)培養(yǎng)基相比，上述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)的培養(yǎng)基能夠有效提高不定芽的分化情況，從而提高拳參的繁殖效率。上述誘導(dǎo)不定芽增殖的培養(yǎng)基中，添加6-ba和tdz兩種分裂素配合使用，對增殖率有明顯提高，且對不定芽的長勢影響較小。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基為在ms培養(yǎng)基中添加如下組分得到：6-ba?1.0-2.0mg/l，naa?0.2-0.4mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述不定芽增殖使用的培養(yǎng)基為在ms培養(yǎng)基中添加如下組分得到：6-ba?2.0-3.0mg/l，tdz?0.5-1.0mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

17、優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基以1/2?ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：活性炭?0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

18、配合上述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)培養(yǎng)和不定芽增殖培養(yǎng)，得到的不定芽能夠在上述誘導(dǎo)不定芽生根培養(yǎng)基及自身合成的各類激素的共同作用下，促進生根形成小苗。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，誘導(dǎo)不定芽生根培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為在1/2?ms培養(yǎng)基中添加活性炭?0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l和瓊脂4-4.5g/l得到。

20、以上所述的誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)使用的培養(yǎng)基、不定芽增殖使用的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)不定芽生根使用的培養(yǎng)基的ph優(yōu)選為5.8-6.0。

21、上述組織培養(yǎng)方法中，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)、不定芽增殖和誘導(dǎo)不定芽生根的培養(yǎng)溫度為23-27℃，光照時長為8-10h/d。

22、其中，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)、不定芽增殖的光照強度為1500-2300?lux，誘導(dǎo)不定芽生根的光照強度為2000-2500?lux。

23、以上所述的組織培養(yǎng)方法，在誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)前，對外植體進行消毒處理；所述消毒處理包括：先以70%-80%酒精消毒處理，再以0.08%-0.12%氯化汞溶液消毒處理。

24、優(yōu)選地，所述消毒處理包括：先以75%酒精消毒處理，再以0.1%氯化汞溶液消毒處理。

25、上述消毒處理優(yōu)選為浸泡震蕩處理。

26、優(yōu)選地，所述酒精消毒處理的時間為30-60s；所述氯化汞溶液消毒處理的時間為6-10min。

27、優(yōu)選地，在酒精消毒處理前，先以水沖洗外植體。

28、優(yōu)選地，在酒精消毒后、氯化汞溶液處理后，均以無菌水清洗外植體。

29、在消毒結(jié)束后，將帶有莖生葉處的莖段分割成長為1-2cm的帶芽點小段，獲得待誘導(dǎo)的外植體。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中提供一種拳參的組織培養(yǎng)方法，所述方法包括：外植體的獲取和消毒，誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)，不定芽增殖以及誘導(dǎo)不定芽生根。

31、本發(fā)明提供的拳參的組織培養(yǎng)方法的整體流程如下：對取自生長健壯且無病蟲害的拳參母株上的帶有莖生葉處的莖段消毒處理后，利用誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)的培養(yǎng)基對上述帶有莖生葉處的莖段進行誘導(dǎo)，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，誘導(dǎo)莖段不定芽萌發(fā)。將誘導(dǎo)出的不定芽從莖段上剝離，再利用不定芽增殖使用的培養(yǎng)基對不定芽進行誘導(dǎo)，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，不定芽增殖形成叢生芽。將叢生芽分離成單株，在誘導(dǎo)不定芽生根的培養(yǎng)基上對單株進行生根誘導(dǎo)，形成生根苗。

32、另一方面，本發(fā)明還提供用于拳參組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基和誘導(dǎo)不定芽生根培養(yǎng)基；

33、其中，所述誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：6-ba?1.0-2.0mg/l，naa?0.2-0.4mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l；

34、所述不定芽增殖培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：6-ba?2.0-3.0mg/l，tdz?0.5-1.0mg/l，蔗糖?25-30g/l，瓊脂4-5g/l；

35、所述誘導(dǎo)不定芽生根培養(yǎng)基以1/2?ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基并包括如下組分：活性炭?0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，瓊脂4-5g/l。

36、本發(fā)明還提供以上所述的用于拳參組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基在拳參組織培養(yǎng)中的應(yīng)用。

37、優(yōu)選地，所述應(yīng)用為以拳參的帶有莖生葉處的莖段作為外植體進行組織培養(yǎng)。

38、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明選擇拳參母株帶有莖生葉處的莖段作為外植體進行拳參的組織培養(yǎng)，并針對該外植體開發(fā)了適宜的誘導(dǎo)莖段芽點萌發(fā)、不定芽增殖以及誘導(dǎo)不定芽生根的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。利用本發(fā)明的拳參組織培養(yǎng)方法，能夠有效提高拳參不定芽的誘導(dǎo)成功率，縮短誘導(dǎo)周期，提高拳參的增殖系數(shù)和生根率，從而實現(xiàn)拳參的快速繁殖，促進拳參的應(yīng)用。