一種高效保護(hù)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞線粒體功能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效保護(hù)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞線粒體功能的方法，從而極大提 高冷凍卵母細(xì)胞中線粒體的功能及其發(fā)育能力。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著世界人口的劇增和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，哺乳動物遺傳資源儲備急劇減少， 卵母細(xì)胞的冷凍保存成為保護(hù)物種資源多樣性和拯救瀕危動物的有效手段。同時，它也是 加快家畜品種改良、建立動物基因庫和胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的重要組成部分，并為克隆、轉(zhuǎn)基因 等現(xiàn)代生物技術(shù)提供豐富的試驗(yàn)材料，使卵母細(xì)胞的供給和使用不受時間和空間的限制。
[0003] 然而，盡管哺乳動物和人卵母細(xì)胞冷凍保存研宄逐步開展并取得很大進(jìn)展，但是 卵母細(xì)胞冷凍保存的研宄遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及胚胎或精子冷凍保存的水平。研宄表明，相對于程序法 冷凍而言，玻璃化冷凍保存卵母細(xì)胞的效果要較好，但卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存后的發(fā)育 能力仍明顯下降，例如：牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后進(jìn)行體外受精，囊胚率（17. 50% )較新鮮 卵母細(xì)胞（32.06% )下降了 50%左右。
[0004] 線粒體是細(xì)胞中含量豐富的細(xì)胞器，也是細(xì)胞的能量工廠，它通過氧化磷酸化為 細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動提供ATP，同時它又是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中樞和重要鈣庫。許多研宄已經(jīng) 證實(shí)，線粒體的分布、膜電位等對卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力有著非常重要的影響。目前，關(guān)于玻 璃化冷凍對線粒體冷凍造成的損傷、采用何種方法或措施能夠減輕此損傷，都還缺乏深入 研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述不足，本發(fā)明提供了一種高效保護(hù)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體功能 的方法。
[0006] 本發(fā)明方法是在牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過程中，在牛卵母細(xì)胞體外成熟液、玻璃 化冷凍液中添加MT，來高效保護(hù)牛卵母細(xì)胞中線粒體的功能。
[0007] 優(yōu)選地，所述MT的添加濃度為KT7~KTkiIL更優(yōu)選，所述MT的添加濃度為1(T9M。
[0008] 本發(fā)明還提供用于保護(hù)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中線粒體功能的玻璃化冷凍液，該 冷凍液含有MT，MT的含量優(yōu)選為10_7~KTkiM,更優(yōu)選為10_9M。在本發(fā)明實(shí)施例中，玻璃化 冷凍液為EDFSF40:EG、DMS0和FSF液按照體積比（v/v)2 : 2 : 6混勻，其中FSF液：含有 30%(?八）聚蔗糖？1(：〇1170、0.511蔗糖和20%?83的0?85溶液。
[0009] 此外，本發(fā)明還提供MT在保護(hù)玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞線粒體中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明研宄表明，玻璃化冷凍會顯著性提高牛卵母細(xì)胞中ROS水平，而異常升高 的ROS水平會導(dǎo)致線粒體膜功能異常（如膜電位下降等），MT處理能夠顯著性降低冷凍卵 母細(xì)胞中ROS水平、且與新鮮對照組無顯著性差異。進(jìn)一步研宄表明，玻璃化冷凍會使牛卵 母細(xì)胞中ATP含量顯著降低（新鮮對照組0? 86pmol/卵母細(xì)胞，冷凍對照組0? 58pmol/卵 母細(xì)胞），而在牛卵母細(xì)胞體外成熟液和玻璃化冷凍液中添加MT時，能夠有效保護(hù)卵母細(xì) 胞中線粒體功能，尤其是在添加KT9MT時表現(xiàn)出顯著效果，其ATP產(chǎn)量與新鮮卵母細(xì)胞無顯 著性差異（MT冷凍組0. 84pmol/卵母細(xì)胞，新鮮對照組0. 86pmol/卵母細(xì)胞）。說明在體 外成熟液和玻璃化冷凍液中添加KT9M MT，能夠有效保護(hù)維持線粒體的功能。對冷凍卵母 細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活后發(fā)現(xiàn)，MT冷凍組卵母細(xì)胞孤雌激活后卵裂率（85. 63%，137/160)、囊 胚率（44. 53% ,61/137)均顯著性高于冷凍對照組（54. 30%，101/186 ;26. 73%，37/101)， 且與新鮮對照組（88. 79%，95/107 ;46. 32%，44/95)無顯著性差異，說明MT通過高效保護(hù) 卵母細(xì)胞中線粒體的功能，進(jìn)而促進(jìn)了冷凍卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，操作簡單，對卵母細(xì)胞無毒無害，能有效保護(hù)冷凍卵母細(xì)胞的線粒 體功能及其發(fā)育能力，這對于提高冷凍卵母細(xì)胞的應(yīng)用范圍，具有重要的理論和實(shí)際意義。
[0012] 本發(fā)明的處理方法操作簡單、費(fèi)用不高、本發(fā)明將在牛的卵母細(xì)胞超低溫冷凍研 宄領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1是卵母細(xì)胞中ROS染色圖標(biāo)尺=20 ym;
[0014] 圖2是MT處理、CsA處理對玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞中ROS水平影響的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0016] 實(shí)施例1、MT、環(huán)孢霉素（CsA)對玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞線粒體功能保護(hù)功能的比 較
[0017] 1、卵母細(xì)胞的收集和體外成熟
[0018] 牛卵母細(xì)胞從當(dāng)?shù)赝涝讏鍪占?，保存在加?5 yg/mL青霉素和50 yg/mL鏈霉素 的35°C生理鹽水中2h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，從直徑為2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合 體，挑選至少有3層致密卵丘細(xì)胞的復(fù)合體洗滌后用于體外成熟，約50個卵丘-卵母細(xì)胞 復(fù)合體一組放在500 y L成熟液做成的覆蓋有礦物油的4孔板中38. 5 °C，5 % 0)2最大濕度 條件下培養(yǎng)。成熟液配方:M-199 (GibcoBRL公司，格蘭德島，紐約，美國）和IOyg/mL的卵 泡刺激素$311)，10 1^/1^黃體生成素（1^)，11^/1^雌二醇，10%的胎牛血清$85,6讓(3〇 BRLDivision，格蘭德島，紐約，美國），IOyg/mL的肝素。
[0019] 2、OPS的制備
[0020] 按照Vajta等介紹的方法，做些改變制備OPS管，0.25mL的塑料管（I. M. V，萊格 勒，法國），高溫變軟后人為拉長，用顯微控制儀測量使頂端外部直徑為0. 23mm，管壁厚約 0. 02mnu
[0021] 3、預(yù)處理和玻璃化冷凍液
[0022] 預(yù)處理液：含有10%乙二醇（EG)+10%二甲基亞風(fēng)（DMSO)的DPBS溶液。
[0023] 玻璃化冷凍液EDFSF40 :EG、DMS0和FSF液按照體積比（v/v)2 : 2 : 6混勻
[0024] FSF 液：含有 30% (w/v)聚蔗糖 Ficoll 70、0. 5M 蔗糖和 20% FBS 的 DPBS 溶液
[0025] 4、卵母細(xì)胞的冷凍與解凍
[0026] 體外成熟培養(yǎng)22-24h后，用0. 1%的透明質(zhì)酸酶消化l-2min，消化掉復(fù)合物中的 卵丘細(xì)胞，挑選出有第一極體和胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。卵母細(xì)胞在ED中孵化30s 轉(zhuǎn)入EPFSF40中培養(yǎng)25s，然后裝入OPS管中直接投入液氮中凍存。
[0027] 解凍時，把OPS管從液氮中取出，將裝有卵母細(xì)胞的部分迅速溶于0.25M、38. 5°C 的蔗糖中，用口吸管將卵母細(xì)胞從OPS管吹出放于0. 25M的蔗糖中l(wèi)min，0. 15M的蔗糖中 5min，再