一種gv期卵母細(xì)胞冷凍保存液及冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種卵母細(xì)胞冷凍保存液及冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的冷凍保存指在超低溫（_196°C )條件下抑制細(xì)胞內(nèi)一切新陳 代謝活動(dòng)，并使細(xì)胞被長(zhǎng)期保存，按一定的方式解凍后，又能恢復(fù)其受精、卵裂等發(fā)育潛能 的一種保存技術(shù)。卵母細(xì)胞冷凍保存能夠充分利用各種來源的卵母細(xì)胞，可為體外受精、核 移植、轉(zhuǎn)基因等胚胎工程技術(shù)的研究和應(yīng)用提供大量的實(shí)驗(yàn)材料，且不受時(shí)間和空間的限 制。
[0003] 卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)來源于胚胎冷凍保存，由于細(xì)胞自身所具有的一系列特 殊性質(zhì)，因而冷凍保存的難度較大，其冷凍效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及胚胎的冷凍水平。卵母細(xì)胞體積 大，內(nèi)部水分含量高，內(nèi)容物豐富，如卵母細(xì)胞中含有的大量脂肪粒和囊泡等對(duì)低溫十分敏 感，使得卵母細(xì)胞的冷凍保存受到了很大的限制。因此，建立完善的卵母細(xì)胞冷凍保存方法 尤為重要。目前較為常用的卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)方法有慢（快）速冷凍法和玻璃化冷 凍法。由于玻璃化冷凍法是一種快速降低細(xì)胞溫度的冷凍模式，避免了慢速冷凍過程中細(xì) 胞遭受的機(jī)械損傷，同時(shí)縮短了冷凍處理時(shí)間，簡(jiǎn)化了步驟，并且不需要昂貴的程序降溫儀 器，逐漸成為胚胎和卵母細(xì)胞冷凍保存的趨勢(shì)。
[0004] 卵母細(xì)胞成熟過程主要分為以下幾個(gè)時(shí)期，生發(fā)泡（Germinalvesicle，GV)期、 進(jìn)入成熟狀態(tài)的生發(fā)泡破裂（Germinalvesiclebreakdown，GVBD)和之后的減數(shù)分裂 (Mei 〇Sis，M)期；減數(shù)分裂又分為M I期和M II期，M I進(jìn)一步細(xì)分為中期I、后期I、末期 I。相比之下，以生發(fā)泡（Germinalvesicle，GV)期卵母細(xì)胞為冷凍對(duì)象比成熟卵母細(xì)胞更 具有優(yōu)勢(shì)。
[0005] 盡管目前采用玻璃化冷凍法冷凍保存GV期卵母細(xì)胞已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，但是 冷凍解凍后的卵母細(xì)胞受精卵裂率、囊胚發(fā)育率仍然不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了解決現(xiàn)有卵母細(xì)胞冷凍保存解凍后卵母細(xì)胞受精卵裂率、囊胚發(fā)育率 低的問題，提供一種GV期卵母細(xì)胞冷凍保存液及冷凍保存方法。
[0007] 卵母細(xì)胞冷凍保存平衡液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇、二 甲基亞砜（DMS0)和海藻糖組成；平衡液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度 為2mg/ml、葉酸的濃度為100 yM、乙二醇的體積濃度為7. 5%、二甲基亞砜的體積濃度為 7. 5%、海藻糖的濃度為0. 25M。
[0008] 卵母細(xì)胞冷凍保存液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇和二甲基 亞砜組成；冷凍保存液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的 濃度為100 yM、乙二醇的體積濃度為15%、二甲基亞砜的體積濃度為15%。
[0009] 卵母細(xì)胞冷凍保存解凍液分有解凍液I和解凍液II兩種；解凍液I和解凍液II均 由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸和海藻糖組成，解凍液中胎牛血清的體積濃度為 10%、維生素B12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為lOOyM，解凍液I中海藻糖的濃度為1M， 解凍液II中海藻糖的濃度為0. 5M。
[0010] 卵母細(xì)胞按以下步驟進(jìn)行冷凍保存：
[0011] 將GV期卵母細(xì)胞在平衡液中平衡3分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冷凍保存液中，再立即轉(zhuǎn)移 到冷凍環(huán)上，并迅速投入液氮中冷凍；
[0012] 其中，平衡液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇、二甲基亞砜和海 藻糖組成；平衡液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度 為100 yM、乙二醇的體積濃度為7. 5%、二甲基亞砜的體積濃度為7. 5%、海藻糖的濃度為 0. 25M；
[0013] 冷凍保存液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇和二甲基亞砜組 成；冷凍保存液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為 100 yM、乙二醇的體積濃度為15%、二甲基亞砜的體積濃度為15%;
[0014]所述常規(guī)培養(yǎng)液為DMB1培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16或培養(yǎng)液。
[0015] 冷凍卵母細(xì)胞按以下步驟進(jìn)行解凍：
[0016] 將冷凍保存的卵母細(xì)胞從液氮中取出立即放到解凍液I中3分鐘，再轉(zhuǎn)移到解凍 液II中3分鐘，之后轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)液中3分鐘，即完成冷凍卵母細(xì)胞的解凍；
[0017]其中，解凍液I由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸和海藻糖組成，解凍液I 中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為100 y M、海藻糖 的濃度為1M ;解凍液II由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸和海藻糖組成，解凍液II 中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為100 y M、海藻糖 的濃度為〇. 5M。
[0018] 基礎(chǔ)液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12和葉酸組成；基礎(chǔ)液中胎牛血清的體 積濃度為1〇%、維生素隊(duì) 2的濃度為211^/1]11、葉酸的濃度為100以|/[。
[0019]常規(guī)培養(yǎng)液為DMB1培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16或培養(yǎng)液。
[0020] 本發(fā)明GV期卵母細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物或人的GV期卵母細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明卵母細(xì)胞冷凍保存平衡液、冷凍液和解凍液可有效提高解凍后卵母細(xì)胞經(jīng) 體外受精和孤雌激活后的胚胎發(fā)育率。采用本發(fā)明解凍后經(jīng)體外成熟后受精，囊胚率提高 了 7. 2 %，孤雌激活囊胚率提高了 3 %。
[0022] 本發(fā)明GV期卵母細(xì)胞冷凍保存方法能夠降低玻璃化冷凍引起的損傷，提高卵母 細(xì)胞冷凍保存存活率，提高冷凍保存后卵母細(xì)胞發(fā)育能力，而且成本低廉，便于廣泛推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
[0024]【具體實(shí)施方式】一：本實(shí)施方式卵母細(xì)胞冷凍保存平衡液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、 維生素B12、葉酸、乙二醇、DMS0和海藻糖組成；平衡液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生 素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為100 yM、乙二醇的體積濃度為7. 5%、二甲基亞砜的 體積濃度為7. 5%、海藻糖的濃度為0. 25M ;常規(guī)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16 或MEM培養(yǎng)液。
【具體實(shí)施方式】 [0025] 二：本實(shí)施方式卵母細(xì)胞冷凍保存液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生 素B 12、葉酸、乙二醇和DMS0組成；其中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B12的濃度為 211^/1111、葉酸的濃度為100 1^、乙二醇的體積濃度為15%、01^0的體積濃度為15%;常規(guī)培 養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16或MEM培養(yǎng)液。
【具體實(shí)施方式】 [0026] 三：本實(shí)施方式卵母細(xì)胞冷凍保存解凍液分有解凍液I和解凍液II 兩種；解凍液I和解凍液II均由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B 12、葉酸和海藻糖組成，解 凍液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為100 y M，解 凍液I中海藻糖的濃度為1M，解凍液II中海藻糖的濃度為0. 5M;其中，常規(guī)培養(yǎng)液為DMEM 培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16或MEM培養(yǎng)液。
【具體實(shí)施方式】 [0027] 四：本實(shí)施方式卵母細(xì)胞按以下步驟進(jìn)行冷凍保存：
[0028] 將GV期卵母細(xì)胞在平衡液中平衡3分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冷凍保存液中，再立即轉(zhuǎn)移 到冷凍環(huán)上，并迅速投入液氮中冷凍；
[0029] 其中，平衡液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇、二甲基亞砜和海 藻糖組成；平衡液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度 為100 yM、乙二醇的體積濃度為7. 5%、二甲基亞砜的體積濃度為7. 5%、海藻糖的濃度為 0. 25M；
[0030] 冷凍保存液由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸、乙二醇和二甲基亞砜組 成；冷凍保存液中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為 100 yM、乙二醇的體積濃度為15%、二甲基亞砜的體積濃度為15%;
[0031] 所述常規(guī)培養(yǎng)液為DMB1培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16或培養(yǎng)液。
[0032] 本實(shí)施方式中GV期卵母細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物或人的GV期卵母細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】 [0033] 五：本實(shí)施方式冷凍卵母細(xì)胞按以下步驟進(jìn)行解凍：
[0034] 將冷凍保存的卵母細(xì)胞從液氮中取出立即放到解凍液I中3分鐘，再轉(zhuǎn)移到解凍 液II中3分鐘，之后轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)液中3分鐘，即完成冷凍卵母細(xì)胞的解凍；
[0035] 其中，解凍液I由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、維生素B12、葉酸和海藻糖組成，解凍液I 中胎牛血清的體積濃度為10%、維生素B 12的濃度為2mg/ml、葉酸的濃度為100 y M、海藻糖 的濃度為1M ;解凍液II由常規(guī)培養(yǎng)液、胎牛血清、