專利名稱：一種痢疾多價(jià)基因工程菌苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域中一種痢疾多價(jià)基因工程菌苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
全世界痢疾年發(fā)病例超過2.5億，其中500萬例需住院治療，年死亡約200萬，且十余年的報(bào)告數(shù)據(jù)有增無減。主要流行于發(fā)展中國家。痢疾是常見和多發(fā)傳染病，發(fā)病率始終位于24種法定傳染病的前3位，有逐年下降趨勢，目前年報(bào)告病例約100萬左右，實(shí)際病例數(shù)超過數(shù)倍。發(fā)病以嬰幼兒和青壯年為主，死亡多見于老人和兒童，主要流行型別是福氏和宋內(nèi)氏。痢疾雖有藥物治療，但極易轉(zhuǎn)為慢性，長期帶菌成為潛在傳染源，且抗藥性問題十分嚴(yán)重。WHO推薦的口服補(bǔ)液對(duì)以侵襲腸粘膜上皮細(xì)胞為主要致病特點(diǎn)的痢疾無效，尤其因痢疾腹瀉影響和障礙嬰幼兒正常發(fā)育，影響終生，且越來越多的證據(jù)說明痢疾感染與自身免疫病相關(guān)。尤其近年，我國城市流動(dòng)人口劇增，從事食品及其加工人數(shù)增多，且這部分人的居住與工作環(huán)境惡劣，均給痢疾的傳播與流行提供了適宜環(huán)境、流行途徑和敏感人群。
志賀氏菌屬(Shigella)是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。有K和O抗原而無H抗原。K抗原是自患者新分離的某些菌株的菌體表面抗原，不耐熱，加熱100℃1小時(shí)被破壞。K抗原在血清學(xué)分型上無意義，但可阻止O抗原與相應(yīng)抗血清的凝集反應(yīng)。O抗原分為群特異性抗原和型特異性抗原，前者常在幾種近似的菌種間出現(xiàn)；型特異性抗原的特異性高，用于區(qū)別菌型。根據(jù)志賀氏菌抗原構(gòu)造的不同，可分為四群48個(gè)血清型(包括亞型)(1)A群又稱痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)，通稱志賀氏痢疾桿菌。不發(fā)酵甘露醇。有12個(gè)血清型，其中8型又分為三個(gè)亞型。
(2)B群又稱福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)，通稱福氏痢疾桿菌。發(fā)酵甘露醇。有15個(gè)血清型(含亞型及變種)，抗原構(gòu)造復(fù)雜，有群抗原和型抗原。根據(jù)型抗原的不同，分為6型，又根據(jù)群抗原的不同將型分為亞型；X、Y變種沒有特異性抗原，僅有不同的群抗原。
(3)C群又稱鮑氏志賀氏菌(Sh.boydii)，通稱鮑氏痢疾桿菌。發(fā)酵甘露醇，有18個(gè)血清型，各型間無交叉反應(yīng)。
(4)D群又稱宋內(nèi)氏志賀氏菌(Sh.sonnei)，通稱宋內(nèi)氏痢疾桿菌。發(fā)酵甘露醇，并遲緩發(fā)酵乳糖，一般需要3～4天。只有一個(gè)血清型。有兩個(gè)變異相，即I相和II相；I相為S型，II相為R型。
侵襲蛋白抗原(Ipas)，是各群痢疾桿菌的共同侵襲蛋白抗原(Ipas，包括IpaA、IpaB、IpaC、IpaD)，IpaA、IpaB、IpaC、IpaD是分別具有如序列表中(1、2、3和4)所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，它們的編碼基因分別如序列表中序列(5、6、7和8)所示。
LPS-O多糖抗原，即存在于痢疾桿菌胞壁肽聚糖的外側(cè)為外膜的結(jié)構(gòu)。它同大多數(shù)革蘭氏陰性菌一樣，主要由類脂A，核心多糖及O-特異性側(cè)鏈(O抗原)組成，并與大腸桿菌有很大的相似性。化學(xué)分析表明，福氏及宋內(nèi)氏菌LPS的類脂A與大腸桿菌基因相同，LPS的O特異性側(cè)鏈?zhǔn)菦Q定血清型的主要部位，是痢疾桿菌重要的致病性因子和保護(hù)性抗原。
美、法、日、澳、瑞典、英、蘇、印度等國家長期以來投入大量人力、財(cái)力開展痢疾菌苗及其相應(yīng)基礎(chǔ)研究，痢疾桿菌毒力與致病的分子機(jī)制的研究進(jìn)展促進(jìn)了新一代痢疾菌苗的研制與發(fā)展。目前研制痢疾桿菌苗的方法與途徑主要有1、構(gòu)建雜交株多以沙門氏菌如Ty21a，或E.coli菌為受體株，接受宋內(nèi)氏或福氏2a痢疾菌質(zhì)?；蛉旧w的功能片段構(gòu)建的雜交株。如宋內(nèi)-Ty21a雜交株，人體口服1010cfu安全，對(duì)宋內(nèi)氏野生株的攻擊有40％的保護(hù)效果，但其凍干產(chǎn)品批次間有波動(dòng)，其原因是宋內(nèi)氏LPS-O側(cè)鏈不能與Ty21a的LPS中心糖鏈穩(wěn)定結(jié)合的緣故，正在進(jìn)行改進(jìn)，但未見成功的報(bào)道。
2、構(gòu)建毒力基因減毒突變株主要針對(duì)痢疾菌繁殖和胞內(nèi)外播散的功能基因如VirG(icsA)及其調(diào)控基因或染色體上的arobactin的基因，進(jìn)行插入突變，使該菌株能入侵宿主細(xì)胞，但無法進(jìn)行有效繁殖，已在小動(dòng)物和猴體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)未見人體觀察效果。
3、構(gòu)建痢疾菌毒株的營養(yǎng)缺陷型使Y型痢疾菌由于aroD基因插入失活或缺失，得到福氏痢疾減毒株，它能入侵宿主細(xì)胞，但在胞內(nèi)不能有效繁殖，有2株已進(jìn)行志愿者實(shí)驗(yàn)，但沒有深入在人體大范圍的試驗(yàn)。
上述三類菌苗除2株aroD營養(yǎng)缺陷菌株有人體免疫學(xué)觀察外，其它未見人體II、III期臨床觀察結(jié)果的報(bào)道。從F2a2457毒株和福氏Y型進(jìn)行aroD缺失而構(gòu)建成功的2株減毒株已分別進(jìn)行幾十例志愿者安全及攻擊實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為口服10×108cfu比較安全，在44％的受試者查到陽性血清抗體，副反應(yīng)與服苗劑量有關(guān)，據(jù)說Y型減毒株ΔaroD124在越南現(xiàn)場有效。
4、近年美國將痢疾菌LPS多糖與蛋白如CT-B進(jìn)行交聯(lián)稱為結(jié)合苗，進(jìn)行小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察有效，在越南現(xiàn)場人用觀察也有效，但沒有形成制品。
于1998年獲得國家1類新藥證書和生產(chǎn)批文號(hào)的痢疾雙價(jià)基因工程菌苗(菌株FSM2117)，可同時(shí)表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS-O多糖抗原，經(jīng)小鼠、豚鼠、家兔和猴等不同動(dòng)物模型證明痢疾雙價(jià)基因工程菌苗口服免疫動(dòng)物安全，有雙價(jià)免疫原性、雙價(jià)保護(hù)活性和穩(wěn)定性。并進(jìn)一步用于人群大范圍的現(xiàn)場使用，證明人口服痢疾雙價(jià)基因工程菌苗安全，有雙價(jià)免疫原性和免疫保護(hù)效果。并于1998年12月獲得國家1類新生物制品證書和國家試生產(chǎn)文號(hào)。但該痢疾雙價(jià)基因工程菌苗凍干粉劑口服前必須先口服碳酸氫鈉中和胃酸，并且口服量大及保護(hù)效果還不夠十分理想的問題，而影響免疫保護(hù)效果。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種痢疾多價(jià)基因工程菌苗。
本發(fā)明所提供的痢疾多價(jià)基因工程菌苗，它的活性成分是既表達(dá)侵襲蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS-O多糖抗原的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。
所述痢疾多價(jià)基因工程菌苗的生產(chǎn)培養(yǎng)基為pH為6.5-7.6的厚氏培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基。所述生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為7.2-7.5。
所述厚氏培養(yǎng)基按照如下方法制備新鮮牛肉7500g加入11250ml蒸餾水煮沸40min，冷卻至45℃加入勻漿的新鮮豬胰臟1500mg，調(diào)pH8.0，及加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍稀釋，并加入氯化鈉0.5％，調(diào)pH6.5-7.6備用。
LB培養(yǎng)基由以下成分組成蛋白胨10g、酵母浸出液5g、氯化鈉10g，加水至1000ml，其中所pH優(yōu)選為7.2-7.5。
所述痢疾多價(jià)基因工程菌苗的劑型為口服膠囊劑型或滴鼻劑型兩種。
所述劑型的痢疾多價(jià)基因工程菌苗可采用冷凍干法進(jìn)行制備。
在制備所述劑型的痢疾多價(jià)基因工程菌苗過程中所采用的凍干保護(hù)劑為含有0.5％明膠，5％蔗糖、0.1％維生素C、0.1％谷維素、0.1％脫脂奶粉等的pH7.0-7.6磷酸緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備上述痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的方法，包括以下步驟1)將含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到福氏痢疾桿菌2a型II中，得到含有所述I相質(zhì)粒的重組福氏痢疾桿菌2a型II；2)將含有所述I相質(zhì)粒的重組福氏痢疾桿菌2a型II中的aroD基因缺失，得到既表達(dá)侵襲蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS-O多糖抗原的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。
所述含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒來自于宋內(nèi)氏痢疾菌毒株48025-11或S63等宋內(nèi)氏痢疾菌株。該毒株提供120-140MD的I相大質(zhì)粒，侵襲蛋白及侵襲表型均陽性(具有四種侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，Hela細(xì)胞侵入陽性，接觸性溶血陽性，剛果紅試驗(yàn)陽性，豚鼠角結(jié)合膜試驗(yàn)陽性)。
所述含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒通過誘動(dòng)質(zhì)粒R386轉(zhuǎn)移到福氏痢疾桿菌2a型II中。
所述誘動(dòng)質(zhì)粒R386來自于E.coli。E.coli該菌株提供誘動(dòng)質(zhì)粒R386和選擇性標(biāo)記Kan(卡那霉素)抗性。
所述福氏痢疾桿菌2a型II可為福氏痢疾桿菌2a型II T32菌株。
本發(fā)明的痢疾多價(jià)基因工程菌苗比痢疾雙價(jià)基因工程菌苗增加了各群痢疾桿菌共有的侵襲蛋白抗原(Ipas，包括IpaA、IpaB、IpaC、IpaD)。經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠和猴)口服或滴鼻途徑免疫，結(jié)果證明按第0、3、6周三次口服或滴鼻免疫程序，小鼠口服0.1億、恒河猴口服0.5億、人口服1.0億或小鼠滴鼻0.001億、恒河猴滴鼻0.005億、人滴鼻0.01億的痢疾多價(jià)基因工程菌苗，可產(chǎn)生很好的多價(jià)免疫原性，可保護(hù)免疫小鼠、恒河猴、人有效抵抗S.F2a及S.sonnei毒株的攻擊，并且比痢疾雙價(jià)基因工程菌苗的口服途徑免疫保護(hù)效果提高近30％、滴鼻途徑免疫保護(hù)效果提高30％以上，都能有效誘導(dǎo)粘膜雙價(jià)特異IgA、IgG糞及唾液的抗體反應(yīng)，可提供痢疾桿菌多價(jià)抗原的免疫保護(hù)，并進(jìn)行中試生產(chǎn)及在5省、市、地區(qū)3萬余人的現(xiàn)場考核，可很好有效的預(yù)防細(xì)菌性痢疾。


圖1為本發(fā)明的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的構(gòu)建過程示意圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1.痢疾多價(jià)基因工程菌苗株構(gòu)建、篩選與鑒定1、痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的構(gòu)建與篩選(1)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的構(gòu)建痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的構(gòu)建過程如圖1所示，具體方法如下選擇宋內(nèi)氏痢疾菌毒株48025-11(購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所毒種庫，提供120-140MD的I相大質(zhì)粒pSS120)，表達(dá)與侵襲相關(guān)的IpaA，B，C，D四條侵襲蛋白帶，具有HeLa細(xì)胞侵入，剛果紅試驗(yàn)，接觸性溶血等侵襲表型及豚鼠角結(jié)合膜毒力試驗(yàn)陽性。大腸桿菌E.coli(R386Tn5，Kanr25ug/ml，購于首都兒童醫(yī)院)，提供誘動(dòng)質(zhì)粒R386和篩選的選擇性標(biāo)記卡那霉素抗性。首先將誘動(dòng)質(zhì)粒R386通過接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)到痢疾菌毒株48025-11中，具體方法如下取甘油肉湯保存的提供誘動(dòng)質(zhì)粒R386的大腸桿菌E.coli和痢疾菌毒株48025-11各50μ1分別接種于含和不含卡那霉素的5ml LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，7000rpm離心10分鐘，去上清，菌苔分別用0.2ml LB肉湯懸浮，兩菌混合后涂于LB平板，內(nèi)含Kan(卡那霉素)50ug/ml，37℃溫箱培養(yǎng)30小時(shí)，長出菌落與痢疾宋內(nèi)氏標(biāo)準(zhǔn)血清呈陽性反應(yīng)，連續(xù)在含卡那霉素的LB平板上純化3次，所得菌落既為含有誘動(dòng)質(zhì)粒R386的痢疾菌毒株48025-11。
通過誘動(dòng)質(zhì)粒R386的誘動(dòng)，將I相大質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到福氏2a痢疾菌苗T32(表達(dá)型II，群3，4抗原Str(鏈霉素)r50ug/ml，Ipa-，購于蘭州生物制品研究所)中，具體方法如下將甘油肉湯保存的48025-11(含I相大質(zhì)粒和誘動(dòng)質(zhì)粒R386Kanr)和福氏2a痢疾菌苗T32(Strr)各取50μl分別接種于含Kan(卡那霉素)50ug/ml和含Str(鏈霉素)50ug/ml的5ml LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，7000rpm離心10分鐘去上清，菌苔分別用0.2ml LB肉湯懸浮，兩菌混合后涂于LB平板，內(nèi)含Kan(卡那霉素)50ug/ml，鏈霉素50ug/ml，37℃溫箱培養(yǎng)30小時(shí)，長出菌落與痢疾宋內(nèi)氏及福氏2a型II及群3，4標(biāo)準(zhǔn)血清呈陽性反應(yīng)，連續(xù)在含卡那霉素和鏈霉素的LB平板上純化3次，所得菌落既為目的菌落，該目的菌落為轉(zhuǎn)入I相大質(zhì)粒的福氏2a痢疾菌苗T32，命名為FS-15毒株。FS-15毒株表達(dá)宋內(nèi)氏I相抗原及福氏2a型II，群3，4抗原，并表達(dá)與侵襲相關(guān)的IpaA，B，C，D四條侵襲蛋白帶，具有HeLa細(xì)胞侵入、剛果紅試驗(yàn)陽性，接觸性溶血等侵襲表型，豚鼠角結(jié)合膜毒力試驗(yàn)陽性。
用大腸桿菌NK5131(購于Walter Reed Army Institute of Research，America，含P1噬菌體，Kanr50ug/ml，Tetr12.5ug/ml，Tn10插入滅活的aroD基因)制備P1裂解液，效價(jià)需大于1010方可使用，用P1裂解液和FS-15毒株菌液混合，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將aroD基因轉(zhuǎn)入受體菌中，具體方法如下將甘油肉湯保存的FS-1550μl接種于5ml含Kan50ug/ml的LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)8-9小時(shí)，將其全部轉(zhuǎn)種于200ml含Kan 50ug/ml的LB肉湯中，取60ml菌液離心，4000rpm離心10分鐘，懸于40mlCa，Mg緩沖液(5mM Cacl2，10mM MgSO4)中，37℃水浴30分鐘。每2ml菌液加2ml P1裂解液，37℃吸附30分鐘，4000rpm離心10分鐘，每管懸于0.5ml LB肉湯中，鋪于3塊含50ug/ml卡那霉素和12.5ug/ml Tet(四環(huán)素)的LB平板，42℃培養(yǎng)55小時(shí)，有轉(zhuǎn)導(dǎo)子出現(xiàn)。連續(xù)在含有kan 50ug/ml及Tet 12.5ug/ml的平板上純化3次。將轉(zhuǎn)導(dǎo)子點(diǎn)種在加及不加芳香族氨基酸的M9平板上，挑選芳香族氨基酸缺陷的菌落保存。再經(jīng)過Bochner培養(yǎng)基(蛋白胨10克，酵母5克，金霉素.HCl 50毫克，NaCl 10克，NaH2PO411.3克，瓊脂15克，水1000ml，PH6.0-6.5)，篩選四環(huán)素敏感突變體。再將四環(huán)素敏感株點(diǎn)種在NC膜上，裂解后與a-32P標(biāo)記的1.0Kb的aroD探針作菌落原位雜交(常規(guī)堿變性法提取pKD201質(zhì)粒(購于Cold Spring HarborLaboratory，America)，用ClaI及EcoRV雙酶切，回收1.0kb片段，隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記此片段作為aroD探針，按常規(guī)菌落雜交法進(jìn)行)，呈陰性者為aroD基因缺失株。將aroD基因缺失株在含有nad(尼克酰胺)，VitB1(維生素B1)，asp(天門冬氨酸)，phe(苯丙氨酸)，try(色氨酸)，tyr(酪氨酸)，PABA(對(duì)氨基苯甲酸)，DHB(2.3-二羥基苯甲酸)(均為40ug/ml)的M9培養(yǎng)基上作芳香族氨基酸的營養(yǎng)缺陷鑒定，并以NK5131作為陽性對(duì)照，篩選出4株不能在上述M9培養(yǎng)基上生長的菌株(FS)，該4株菌既表達(dá)雙價(jià)LPS-O多糖抗原，又穩(wěn)定表達(dá)各群痢疾桿菌共同的Ipas蛋白抗原，aroD基因缺失，并具有入侵能力。該4株菌均為痢疾多價(jià)基因工程菌苗株(inv+Ipas+ΔaroD)FS。
(2)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的篩選根據(jù)GeneBank已公布的IpaA，IpaB，IpaC，IpaD基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，以沙門氏菌或大腸桿菌為模板，通過基因擴(kuò)增分別獲得IpaA、IpaB、IpaC、IpaD基因，構(gòu)建于pQE30(購于美國invitrogen公司)原核表達(dá)載體上，導(dǎo)入DH5α受體菌獲得IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重組蛋白的表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化制備了純化的IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重組蛋白抗原。以純化的IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重組蛋白抗原分別加入等量不完全氟氏佐劑乳化后皮下多點(diǎn)免疫BALB/c鼠，三次免疫后測抗體效價(jià)，取其免疫BALB/c小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，篩選IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗體陽性的雜交瘤細(xì)胞株。采用有限稀釋獲得產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并進(jìn)一步用ELISA鑒定IpaA、IpaB、IpaC、IpaD雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體是針對(duì)IpaA，IpaB，IpaC，IpaD保護(hù)性表位的單克隆細(xì)胞株(分別為3G11、2E8、5F2、5D3)，經(jīng)抗體亞型分析鑒定分別是IgG2a、IgG1b、IgG1a、IgG2b。
采用Western blotting雜交檢測痢疾多價(jià)基因工程菌苗株表達(dá)IpaA，IpaB，IpaC，IpaD侵襲蛋白抗原的情況，具體方法是痢疾多價(jià)基因工程菌苗株與SDS-PAGE上樣緩沖液加熱煮沸上樣，進(jìn)行10％SDS-PAGE，分別以上述針對(duì)IpaA，IpaB，IpaC，IpaD保護(hù)性表位的抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自英國Amersham公司)為二抗進(jìn)行Western blotting，雜交結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株樣品中得到了70kDa的IpaA雜交條帶，62kDa的IpaB雜交條帶，42kDa的IpaC雜交條帶，36kDa的IpaD；說明本發(fā)明的4株痢疾多價(jià)基因工程菌苗株可表達(dá)IpaA，IpaB，IpaC，IpaD。
2、4株痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的鑒定①入侵表型鑒定宋內(nèi)氏、福氏2a型II、群3、4標(biāo)準(zhǔn)菌株(購于國家藥品生物制品檢定所)。
將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株活化培養(yǎng)后稀釋進(jìn)行普通平板劃線，37℃培養(yǎng)20-22h，挑單個(gè)菌落與福氏型II，群3，4及宋內(nèi)氏I相因子、和侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗體做玻片凝集試驗(yàn)，觀察入侵表型。具體方法是分別將宋內(nèi)氏、福氏2a型II、群3、4標(biāo)準(zhǔn)菌株(購于中國藥品生物制品檢定所)滴于玻片，刮取適量的菌苔，分別加入相應(yīng)的侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗體凝集反應(yīng)，結(jié)果顯示，多價(jià)宋氏、福氏及侵襲蛋白抗原均與IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗體發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)，表現(xiàn)宋內(nèi)氏+++、福氏2a型II+++、群3、4+++和IpaA+++、IpaB+++、IpaC+++、IpaD+++呈多價(jià)強(qiáng)凝集反應(yīng)(“+++”表示強(qiáng)凝集反應(yīng))。
A、侵襲蛋白表達(dá)的鑒定選用賀氏肉湯培養(yǎng)基分別培養(yǎng)18h痢疾多價(jià)基因工程菌苗株和痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117(做對(duì)照)，離心后棄上清用生理鹽水洗一次，恢復(fù)原體積加等量樣品處理液(1％溴酚藍(lán))煮沸，加樣進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移膜上用牛血清蛋白-PBS封閉，然后加入相應(yīng)的鼠抗IpaA，IpaB，IpaC，IpaD單克隆抗體為一抗，室溫過夜PBS洗幾次，再加入以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自英國Amersham公司)37℃溫浴，PBS洗幾次后DAB顯色。WB(免疫印跡試驗(yàn))、ELISA、Immunoblot結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株與宋內(nèi)氏、福氏2a型II、群3、4和侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD的抗體呈多價(jià)抗原陽性反應(yīng)，而痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117與宋內(nèi)氏、福氏2a型II、群3、4的LPS-O呈陽性反應(yīng)，但與侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD的單克隆抗體呈陰性反應(yīng)。
B、剛果紅吸附實(shí)驗(yàn)的鑒定將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株、痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117、T32減毒株(陰性對(duì)照)、F2a-12強(qiáng)毒株(陽性對(duì)照)分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37℃振搖過夜，分別接種在含0.01％剛果紅的LB平皿上劃線，再37℃培養(yǎng)過夜。結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117、T32減毒株不吸收剛果紅菌苔為半透明呈乳白色，F(xiàn)2a-12強(qiáng)毒株吸收剛果紅菌苔呈強(qiáng)紅色，而痢疾多價(jià)基因工程菌苗株吸收剛果紅菌苔為紅色，但程度低于F2a-12強(qiáng)毒株，其程度并介于陰性和陽性之間。
C、接觸性溶血實(shí)驗(yàn)的鑒定將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株、痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117、T32減毒株(陰性對(duì)照)、F2a-12強(qiáng)毒株(陽性對(duì)照)分別接種于賀氏肉湯培養(yǎng)基，37℃振搖過夜，離心洗兩次，同時(shí)將保存液中豚鼠血細(xì)胞離心洗4次，并將豚鼠血細(xì)胞及待測樣品混勻37℃2h，然后離心取上清，紫外檢測570nm OD值。結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株OD值明顯小于F2a-12強(qiáng)毒株，而明顯高于非侵襲性痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。
D、Hela細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)的鑒定將培養(yǎng)的4×104個(gè)細(xì)胞/ml的Hela細(xì)胞放入裝有小蓋玻片的小瓶培養(yǎng)24h，將新培養(yǎng)的待檢菌株稀釋為5×108CFU/ml，等量加入Hela細(xì)胞瓶感染2h，取出該玻片PBS洗4次，用甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計(jì)1000個(gè)Hela細(xì)胞，計(jì)算菌株對(duì)Hela細(xì)胞的入侵?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，F(xiàn)2a-12強(qiáng)毒株侵入Hela細(xì)胞數(shù)是80％，痢疾多價(jià)基因工程菌苗菌株侵入Hela細(xì)胞數(shù)是36％，而痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117侵入Hela細(xì)胞數(shù)是2％。
②安全性鑒定將50億CFU痢疾多價(jià)基因工程菌苗株放入豚鼠的一只眼睛的結(jié)膜囊中，而另一只眼睛不作任何處理作為空白對(duì)照，按常規(guī)方法進(jìn)行痢疾多價(jià)基因工程菌苗豚鼠角結(jié)膜試驗(yàn)，結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株對(duì)豚鼠無致病性；小鼠毒力實(shí)驗(yàn)達(dá)到菌苗安全要求(小鼠腹腔注入5×109cfu，無死亡)。猴體口服200億CFU痢疾多價(jià)基因工程菌苗株、小鼠腹腔注入10億CFU痢疾多價(jià)基因工程菌苗株均無不良反應(yīng)。痢疾多價(jià)基因工程菌苗株小鼠LD50檢測，結(jié)果證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的小鼠LD50值與痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117相當(dāng)。至此完成痢疾多價(jià)菌苗的毒性與毒力實(shí)驗(yàn)全部鑒定，證明該痢疾多價(jià)基因工程菌苗株使用安全。
③穩(wěn)定性鑒定將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的種子庫和工作庫菌株分別傳60代，通過不同生物表型剛果紅吸附、接觸性溶血、Hela細(xì)胞入侵識(shí)別侵襲蛋白抗原單抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB(免疫印跡試驗(yàn))、ELISA、Immunoblot等方法進(jìn)行雙價(jià)LPS-O保護(hù)性抗原，Ipas侵襲蛋白抗原及生物表型穩(wěn)定性的觀測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株傳60代及保存5年能穩(wěn)定表達(dá)保護(hù)性LPS-O抗原和侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD，且入侵等生物表型穩(wěn)定。
對(duì)歷時(shí)5年的不同批次的口服膠囊或滴鼻凍干制劑及對(duì)近200例志愿者排除菌苗，逐個(gè)進(jìn)行生化、遺傳學(xué)及抗原表達(dá)的系統(tǒng)檢測，證明排除菌與口服膠囊菌苗及滴鼻菌苗在質(zhì)粒大小、生化特性、抗原表達(dá)及豚鼠角膜試驗(yàn)等方面無差異，與實(shí)驗(yàn)室大量動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果一致，證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株穩(wěn)定性良好。
保存1年的成品制劑，除痢疾多價(jià)基因工程菌苗株活菌數(shù)有5-8％的下降外，在遺傳學(xué)、生化學(xué)、抗原表達(dá)等方面均無改變，由此證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株穩(wěn)定性良好。
④免疫原性鑒定A)將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫小鼠3次，每次0.1億CFU，同時(shí)用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117口服免疫小鼠3次，每次10億CFU，每次間隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及腸、生殖道沖洗液檢測IgA、IgG特異抗體的產(chǎn)生情況。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640和640、640、640、320)，IgG分別是(2560、1280和640、640、640、640)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、2560和1280、1280、1280、12800)，IgG分別是(2560、1280和1280、1280、1280、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、1280和640、640、640、640)，IgG分別是(1280、640和320、640、320、640)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640和640、640、640、640)，IgG分別是(1280、640和320、320、320、320)。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗株FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(640、640)，IgG分別是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、1280)，IgG分別是(1280、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640)，IgG分別是(640、320)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(640、320)。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫小鼠特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗。尤以血及肺灌洗液的多價(jià)特異抗體反應(yīng)更為明顯，且能誘導(dǎo)生殖道及腸內(nèi)的抗體反應(yīng)。
B)將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫小鼠3次，每次0.001億CFU，同時(shí)用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117滴鼻免疫小鼠3次，每次0.1億CFU，每次間隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及腸、生殖道沖洗液IgA、IgG特異抗體的反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分別是(5120、2560和1280、1280、1280、12800)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、1280、1280、12800)，IgG分別是(5120、2560和1280、1280、640、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分別是(1280、640和640、640、640、640)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、6400、640、640)，IgG分別是(1280、640和640、640、320、320)。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640)，IgG分別是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、1280)，IgG分別是(2560、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640)，IgG分別是(640、640)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(640、320)。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫小鼠特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多價(jià)特異抗體反應(yīng)更為明顯，且能誘導(dǎo)生殖道及腸內(nèi)的抗體反應(yīng)。
C)將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫恒河猴3次，每次0.2億CFU，同時(shí)用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117口服免疫恒河猴3次，每次5.0億CFU，每次間隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及腸、生殖道沖洗液IgA、IgG特異抗體的反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、640和640、640、640、640)，IgG分別是(2560、1280和1280、1280、640、640)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(6400、2560和2560、1280、2560、12800)，IgG分別是(5120、1280和1280、1280、2560、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分別是(2560、1280和640、640、640、640)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和640、1280、640、640)，IgG分別是(1280、640和640、640、640、640)。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、640)，IgG分別是(1280、640)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280)，IgG分別是(1280、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、640)，IgG分別是(640、640)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(320、160)，IgG分別是(640、160)。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫恒河猴特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多價(jià)特異抗體反應(yīng)更為明顯，且能誘導(dǎo)生殖道及腸內(nèi)的抗體反應(yīng)。
D)將痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫恒河猴3次，每次0.005億CFU，同時(shí)用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117滴鼻免疫恒河猴3次，每次0.5億CFU，每次間隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及腸、生殖道沖洗液IgA、IgG特異抗體的反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、1280、1280、640)，IgG分別是(6400、2560和1280、1280、640、1280)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(6400、5120和2560、2560、2560、25600)，IgG分別是(5120、5120和2560、2560、2560、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、1280、1280、1280)，IgG分別是(2560、1280和1280、1280、640、1280)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、1280、1280、640)，IgG分別是(1280、1280和1280、640、12800、640)。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、1280)，IgG分別是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(5120、2560)，IgG分別是(1280、1280)；腸洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(640、320)；生殖道沖洗液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(640、320)。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫恒河猴特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多價(jià)特異抗體反應(yīng)更為明顯，且能誘導(dǎo)生殖道及腸內(nèi)的抗體反應(yīng)。
以上在小鼠、恒河猴體內(nèi)的結(jié)果同時(shí)可見，滴鼻是口服免疫劑量的近1％用量，在小鼠、恒河猴均產(chǎn)生了較好的免疫原性，且滴鼻免疫好于口服免疫途徑的效果。
⑤免疫保護(hù)性鑒定在已有痢疾多價(jià)基因工程疫苗、痢疾雙價(jià)基因工程疫苗口服、滴鼻兩條途徑免疫小鼠、恒河猴動(dòng)物模型上，分別用100LD50福氏桿菌、宋內(nèi)氏強(qiáng)毒株(購于中國藥品生物制品檢定所)滴鼻、口服攻毒觀察痢疾多價(jià)基因工程疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程疫苗口服免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是90％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是84％，滴鼻免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是95％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是88％；痢疾多價(jià)基因工程疫苗口服免疫恒河猴對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是92％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是88％，滴鼻免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是98％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是92％。而痢疾雙價(jià)基因工程疫苗FSM2117口服免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是50％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是41％，滴鼻免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是56％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是48％；痢疾雙價(jià)基因工程疫苗FSM2117口服免疫恒河猴對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是46％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是40％，滴鼻免疫小鼠對(duì)福氏毒株的免疫保護(hù)是55％、對(duì)宋內(nèi)氏毒株的免疫保護(hù)效果是48％。
以上在小鼠、恒河猴體內(nèi)的免疫保護(hù)效果結(jié)果可見，滴鼻免疫劑量比口服降低消耗100倍以上，且痢疾多價(jià)基因工程菌苗株比痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117免疫保護(hù)效果提高了近30％以上。說明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株免疫原性和免疫保護(hù)性好于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。
⑥人體安全性、免疫原性和保護(hù)性鑒定在完成痢疾多價(jià)基因工程菌苗株實(shí)驗(yàn)室研究，證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全、有效的基礎(chǔ)上，連續(xù)5年在五個(gè)不同省、市、地區(qū)，對(duì)5-59歲共計(jì)2萬余人進(jìn)行3次全程口服痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。對(duì)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的安全性、免疫原性和保護(hù)效果進(jìn)行了嚴(yán)格的考核和評(píng)價(jià)結(jié)果表明A)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株人服用安全痢疾多價(jià)基因工程菌苗株對(duì)10634例志愿者口服免疫劑量100億CFU、對(duì)10000例志愿者滴鼻免疫劑量50億CFU，其副反應(yīng)率分別是0.136％、0.108％；痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117對(duì)5000例志愿者口服免疫劑量100億CFU、對(duì)3800例志愿者滴鼻免疫劑量50億CFU，其副反應(yīng)率分別是0.114％、0.110％；用0.5％明膠，5％蔗糖、0.2％維生素C、0.1％谷維素、0.1％脫脂奶粉制劑敷料制備的口服、滴鼻劑型做為安慰劑，對(duì)5000例志愿者口服免疫安慰劑100g、對(duì)5000例志愿者滴鼻免疫安慰劑10g，安慰劑組副反應(yīng)率分別是0.086％、0.119％。從以上痢疾多價(jià)基因工程菌苗株、痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117和安慰劑組間副反應(yīng)沒有差異。證明人使用口服、滴鼻痢疾多價(jià)基因工程菌苗株安全。
B)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性按隨機(jī)、均衡、雙盲原則，先后對(duì)5353例志愿者進(jìn)行口服免疫1.0億CFU，免疫三次，免疫間隔時(shí)間分別為0、2、4周，并用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117先后對(duì)1100例志愿者進(jìn)行口服免疫40億CFU，免疫三次，免疫間隔時(shí)間分別為0、2、4周。兩者免疫完成后的180d采集血清、糞便與唾液，進(jìn)行抗福氏、抗宋內(nèi)氏及Ipas特異IgA、IgG的ELISA檢測。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是1280、1280和640、640、640、640，IgG分別是1280、1280和640、640、640、320；糞便sIgA特異抗體效價(jià)分別是1280、1280和640、640、320、320，IgG分別是1280、640和640、320、320、160；唾液sIgA特異抗體效價(jià)分別是640、320和160、160、160、160，IgG分別是640、640和320、320、160、320。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是640、320，IgG分別是640、640；糞便sIgA特異抗體效價(jià)分別是320、160，IgG分別是640、320；唾液sIgA特異抗體效價(jià)分別是320、160，IgG分別是160、80。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株人口服免疫特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。糞便雙價(jià)特異IgA比服苗前效價(jià)4倍增高率為68％-81％，唾液雙價(jià)抗體效價(jià)4倍增高率為75-91％，且有侵襲蛋白抗體。充分證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株有良好的多價(jià)免疫原性。能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的多價(jià)粘膜抗體反應(yīng)。進(jìn)一步收集半年腹瀉病例，按實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢測、確診、統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株口服免疫對(duì)兒童提供91.8％，成人86.5％的保護(hù)率。其中對(duì)福氏2a保護(hù)率為89.8％，對(duì)宋內(nèi)氏84.6％，對(duì)異型痢疾的保護(hù)率為76.8％。
C)痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫有良好的免疫原性和保護(hù)性按隨機(jī)、均衡、雙盲原則，先后對(duì)3000例志愿者進(jìn)行滴鼻免疫0.01億CFU，免疫三次，免疫間隔時(shí)間分別為0、2、4周，并用痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117先后對(duì)1400例志愿者進(jìn)行滴鼻免疫1.0億CFU，免疫三次，免疫間隔時(shí)間分別為0、2、4周。兩者免疫完成后180d采集血清、糞便與唾液抗福氏、抗宋內(nèi)氏及Ipas特異IgA、IgG的檢測。ELISA結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗株抗福氏、抗宋內(nèi)氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(2560、1280和1280、1280、640、640)，IgG分別是(2560、2560和640、640、640、320)；糞便sIgA特異抗體效價(jià)分別是(1280、1280和640、1280、640、640)，IgG分別是(1280、1280和640、640、640、640)；唾液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、640和320、320、320、160)，IgG分別是(640、320和320、320、640、640)。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋內(nèi)氏血清IgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(1280、640)；糞便sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、320)，IgG分別是(640、320)；唾液sIgA特異抗體效價(jià)分別是(640、640)，IgG分別是(320、320)。結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株人滴鼻免疫特異IgG和IgA抗體高于痢疾雙價(jià)基因工程菌苗FSM2117。糞便雙價(jià)特異IgA比滴鼻苗前效價(jià)4倍增高率為78％-88％，唾液雙價(jià)抗體效價(jià)4倍增高率為70-92％，且有侵襲蛋白抗體。充分證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株有良好的多價(jià)免疫原性。能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的多價(jià)粘膜抗體反應(yīng)。進(jìn)一步收集半年腹瀉病例，按實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢測、確診、統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗株滴鼻免疫對(duì)兒童提供98.0％，成人89.6％的保護(hù)率。其中對(duì)福氏2a保護(hù)率為93.4％，對(duì)宋內(nèi)氏88.9％，對(duì)異型痢疾的保護(hù)率為89.1％。
實(shí)施例2、痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑的生產(chǎn)痢疾多價(jià)基因工程菌苗口服膠囊制劑的生產(chǎn)工藝如下將一支種子管中的痢疾多價(jià)基因工程凍干菌株苗(40億CFU/支)，接入厚氏液體培養(yǎng)液(新鮮牛肉7500g加入11250ml蒸餾水煮沸40min，冷卻至45℃加入勻漿的新鮮豬胰臟1500mg，調(diào)pH8.0，加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍稀釋，并加入氯化鈉0.5％，調(diào)pH7.2-7.4備用)或LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母浸出液5g，氯化鈉10g，加水至1000ml，pH為7.2-7.5)的3.0L培養(yǎng)瓶中，37℃，150-200rpm振蕩培養(yǎng)13-15h，直接注入裝有8500ml厚氏液體培養(yǎng)液或LB培養(yǎng)基的10L培養(yǎng)瓶中，37℃，靜止培養(yǎng)6-8h，注入裝有180升厚氏液體培養(yǎng)液或LB培養(yǎng)基的180L培養(yǎng)罐中，37℃，靜止培養(yǎng)6-8h，調(diào)節(jié)pH7.2，離心，收集菌體。菌苗與藥用敷料組成混合物，制成單劑裝容器中，用于生產(chǎn)痢疾多價(jià)基因工程凍干菌苗口服膠囊、滴鼻劑型。
1、痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干口服膠囊劑型的生產(chǎn)將上述收集到的濕菌體懸于含有0.5％明膠，5％蔗糖、0.2％維生素C、0.1％谷維素、0.1％脫脂奶粉，pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，使菌液的濃度為100億CFU/ml，放于凍干盤內(nèi)，-30℃，2-4h，真空達(dá)85uHg，升溫到30℃，恒溫，干燥20h，得到痢疾多價(jià)基因工程凍干菌苗凍干粉，置6-8℃，進(jìn)行純菌試驗(yàn)，結(jié)果表明存活率＞40％，水分＜3％，通過不同生物表型剛果紅吸附、接觸性溶血、Hela細(xì)胞入侵識(shí)別保護(hù)性抗原單抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB、ELISA、Immunoblot等方法篩選和鑒定入侵表型(inv+)的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干粉能表達(dá)雙價(jià)LPS-O保護(hù)性抗原和Ipas抗原。將痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干粉與蔗糖、羧甲基淀粉鈉、乳糖、可壓性淀粉、硬脂酸鎂按一定比例混勻，在口服膠囊GMP條件下制備膠囊劑型。使每粒口服膠囊的組成為痢疾多價(jià)基因工程菌苗株1.0億CFU活菌、蔗糖15mg、羧甲基淀粉鈉15mg、乳糖20mg、可壓性淀粉20mg、硬脂酸鎂0.4mg。
2、痢疾多價(jià)基因工程凍干菌苗滴鼻劑型的生產(chǎn)將上述收集到的多價(jià)基因工程菌苗懸于含有0.5％明膠，5％蔗糖、0.2％維生素C、0.1％谷維素、0.1％脫脂奶粉，pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，使菌液的活菌數(shù)為10億CFU/ml，分裝凍干盤內(nèi)，-30℃，2-4h，真空達(dá)85uHg，升溫到30℃，恒溫，干燥20h，得到痢疾多價(jià)基因工程凍干菌苗粉劑。置6-8℃，進(jìn)行純菌試驗(yàn)，結(jié)果表明存活率＞40％，水分＜3％，通過不同生物表型剛果紅吸附、接觸性溶血、Hela細(xì)胞入侵識(shí)別保護(hù)性抗原單抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB、ELISA、Immunoblot等方法篩選和鑒定入侵表型(inv+)的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痢疾多價(jià)基因工程菌苗菌凍干粉能表達(dá)雙價(jià)LPS-O保護(hù)性抗原和Ipas抗原。使每瓶滴鼻劑型的組成為痢疾多價(jià)基因工程菌苗0.1億/瓶CFU凍干活菌，用前與0.2ml/瓶生理鹽水(內(nèi)含1％BL-9(9-十二烷基醚)、2％液體石蠟)溶解呈均勻的懸液備用。
3、將步驟1和步驟2得到的兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑進(jìn)行以下鑒定1)純度試驗(yàn)將制品稀釋后，接種于厚氏大瓊脂斜面(新鮮牛肉750g加入1125ml蒸餾水煮沸40min，冷卻至45℃加入勻漿的新鮮豬胰臟150mg，調(diào)pH8.0，及加入三氯甲烷20ml，消化7d，用前4倍蒸餾水稀釋，并加入氯化鈉0.5％，調(diào)pH7.2-7.4，瓊脂粉1.5g)或LB瓊脂斜面(蛋白胨1.0g、酵母浸出液0.5g、氯化鈉1.0g、瓊脂粉1.5g，加水至100ml)，37℃培養(yǎng)48h，兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑均無雜菌生長。
2)抗原表達(dá)將稀釋后的制品菌苗于厚氏大瓊脂斜面(新鮮牛肉7500g加入11250ml蒸餾水煮沸40min，冷卻至45℃加入勻漿的新鮮豬胰臟1500mg，調(diào)pH8.0，及加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍蒸餾水稀釋，并加入氯化鈉0.5％，調(diào)pH7.2-7.4備用，)或LB瓊脂斜面(蛋白胨1.0g、酵母侵出液0.5g、氯化鈉1.0g、瓊脂粉1.5g，加水至100ml)劃線，37℃培養(yǎng)20-22h，挑單個(gè)菌落與福氏型II，群3，4及宋內(nèi)氏I相因子、和侵襲蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD血清做玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑均呈4+多價(jià)強(qiáng)凝集反應(yīng)。
3)活菌率及水分檢測用比濁法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用凱氏方法測水分含量，三批上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑活菌率及水分檢測結(jié)果如表1所示，三批上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑的生化反應(yīng)如表2所示。
表1.兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑活菌率及水分檢測結(jié)果

注6010和6011為膠囊，6012為滴鼻劑將過夜培養(yǎng)的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株、分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和蔗糖的生化反應(yīng)管(購于中國藥品生物制品檢定所)，37℃培養(yǎng)24h，觀察其反應(yīng)，反應(yīng)管由綠色變?yōu)樘m色為陽性(+)，兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑生化反應(yīng)結(jié)果見表2表2.兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑生化反應(yīng)結(jié)果

注6010和6011為痢疾多價(jià)基因工程菌苗口服膠囊，6012為痢疾多價(jià)基因工程菌苗滴鼻劑；FSM2117為痢疾雙價(jià)基因工程菌苗口服制劑，“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)。
4)家兔抗體產(chǎn)生試驗(yàn)每次取各批上述兩種制劑1支，用滅菌生理鹽水稀釋至6-20億/ml，耳靜脈途徑免疫健康新西蘭大耳白家兔，共三次(0.25ml，0.5ml，0.5ml)，每次間隔7天，每批制品免疫3只家兔，末次免疫后3-10天采血，測血清抗體效價(jià)。ELISA測定的要點(diǎn)是，分別用Sh.Sonnei、Sh.flexneri、Ipas分別包被酶聯(lián)板，放4℃冰箱過夜，用PBS洗板，加入倍比稀釋的免疫兔血清放37℃孵箱2.0h，用碳酸緩沖液洗板，加入稀釋的酶標(biāo)羊抗兔抗體放37℃孵箱1.0h，隨后用2N硫酸中止反應(yīng)，在紫外分光光度儀上測定，并換算抗體效價(jià)。結(jié)果如表3所示，表明上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑均有良好的免疫原性。
表3.兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑的血清凝集抗體效價(jià)

注6010和6011為膠囊，6012為滴鼻劑。
5)毒力試驗(yàn)采用豚鼠角膜試驗(yàn)，取上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗制劑活化后的菌苔(直徑3mm，約50億活菌)，涂入豚鼠角結(jié)膜囊中，觀察7天，三批上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑均未引起任何炎癥反應(yīng)。
6)Ipas檢測將上述兩種痢疾多價(jià)基因工程菌苗凍干制劑接種厚氏液體培養(yǎng)液(新鮮牛肉750g加入1125ml蒸餾水煮沸40min，冷卻至45℃加入勻漿的新鮮豬胰臟150mg，調(diào)pH8.0，及加入三氯甲烷20ml，消化7d，用前4倍蒸餾水稀釋，并加入氯化鈉0.5％，調(diào)pH7.2-7.4備用)或LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g、酵母浸出液5g、氯化鈉10g，加水至1000ml，pH7.2-7.5)，待菌濃度達(dá)1010cfu/ml(37℃培養(yǎng)20小時(shí))，用10％SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明痢疾多價(jià)基因工程菌苗均比痢疾雙價(jià)基因工程菌苗株增加了侵襲蛋白的抗原蛋白。
7)系統(tǒng)的入侵表型鑒定對(duì)歷時(shí)2年的不同批次的口服膠囊或滴鼻制劑對(duì)近200例志愿者采集糞便逐個(gè)進(jìn)行生化、遺傳學(xué)及抗原表達(dá)的系統(tǒng)檢測，證明糞便排出的痢疾多價(jià)基因工程菌苗與口服及滴鼻痢疾多價(jià)基因工程菌苗在質(zhì)粒大小、生化特性、抗原表達(dá)及豚鼠角膜試驗(yàn)等方面無差異，與實(shí)驗(yàn)室大量動(dòng)物剛果紅吸附、接觸性溶血、Hela細(xì)胞入侵試驗(yàn)結(jié)果一致，證明痢疾多價(jià)基因工程菌苗有很好的入侵表型。
序列表<160>8<210>1<211>633<212>PRT<213>志賀氏菌屬(Shigella)<400>1Met His Asn Val Asn Asn Thr Gln Ala Pro Thr Phe Leu Tyr Lys Ala1 5 10 15Thr Ser Pro Ser Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Leu Lys Ser Lys Ile Ser20 25 30Asp Ile His Ser Ser Gln Thr Ser Leu Lys Thr Pro Ala Ser Val Ser35 40 45Glu Lys Glu Asn Phe Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Cys Leu Asp Phe50 55 60Leu Phe Ser Ser Ser Gly Lys Glu Asp Val Leu Arg Ser Ile Tyr Ser65 70 75 80Asn Ser Met Asn Ala Tyr Ala Lys Ser Glu Ile Leu Glu Phe Ser Asn85 90 95Val Leu Tyr Ser Leu Val His Gln Asn Asp Leu Asn Phe Glu Asn Glu100 105 110Lys Gly Leu Gln Lys Ile Val Ala Gln Tyr Ser Glu Leu Ile Ile Lys115 120 125Asp Lys Leu Ser Gln Asp Ser Ala Phe Gly Pro Trp Ser Ala Lys Asn130 135 140Lys Lys Leu His Gln Leu Arg Gln Asn Ile Glu His Arg Leu Ala Leu145 150 155 160Leu Ala Gln Gln His Thr Ser Gly Glu Ala Leu Ser Leu Gly Gln Lys165 170 175
Leu Leu Asn Thr Glu Val Ser Ser Phe Ile Lys Asn Asn Ile Leu Ala180 185 190Glu Leu Lys Leu Ser Asn Glu Thr Val Ser Ser Leu Lys Leu Asp Asp195 200 205Leu Val Asp Ala Gln Ala Lys Leu Ala Phe Asp Ser Leu Arg Asn Gln210 215 220Arg Lys Asn Thr Ile Asp Ser Lys Gly Phe Gly Ile Gly Lys Leu Ser225 230 235 240Arg Asp Leu Asn Thr Val Ala Val Phe Pro Glu Leu Leu Arg Lys Val245 250 255Leu Asn Asp Ile Leu Glu Asp Ile Lys Asp Ser His Pro Ile Gln Asp260 265 270Gly Leu Pro Thr Pro Pro Glu Asp Met Pro Asp Gly Gly Pro Thr Pro275 280 285Gly Ala Asn Glu Lys Thr Ser Gln Pro Val Ile His Tyr His Ile Asn290 295 300Asn Asp Asn Arg Thr Tyr Asp Asn Arg Val Phe Asp Asn Arg Val Tyr305 310 315 320Asp Asn Ser Tyr His Glu Asn Pro Glu Asn Asp Ala Gln Ser Pro Thr325 330 335Ser Gln Thr Asn Asp Leu Leu Ser Arg Asn Gly Asn Ser Leu Leu Asn340 345 350Pro Gln Arg Ala Leu Val Gln Lys Val Thr Ser Val Leu Pro His Ser355 360 365Ile Ser Asp Ala Val Gln Thr Phe Ala Asn Asn Ser Ala Leu Glu Lys370 375 380Val Phe Asn His Thr Pro Asp Asn Ser Asp Gly Ile Gly Ser Asp Leu385 390 395 400Leu Thr Thr Ser Ser Gln Glu Arg Ser Thr Asn Asn Ser Leu Ser Arg405 410 415Gly His Arg Pro Leu Asn Ile Gln Asn Ser Ser Thr Thr Pro Pro Leu420 425 430
His Pro Glu Gly Val Thr Ser Ser Asn Asp Asn Ser Ser Asp Thr Thr435 440 445Lys Ser Ser Ala Ser Leu Ser His Arg Val Ala Ser Gln Ile Asn Lys450 455 460Phe Asn Ser Asn Thr Asp Ser Lys Val Leu Gln Thr Asp Phe Leu Ser465 470 475 480Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Thr Arg Glu Thr Ile Phe Glu Ala Ser485 490 495Lys Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Asn Leu Ile Ser Leu Ile Gly Thr500 505 510Lys Ser Gly Thr Gln Glu Arg Glu Leu Gln Glu Lys Ser Lys Asp Ile515 520 525Thr Lys Ser Thr Thr Glu His Arg Ile Asn Asn Lys Leu Lys Val Thr530 535 540Asp Ala Asn Thr Ile Asn Tyr Val Thr Glu Thr Asn Ala Asp Thr Ile545 550 555 560Asp Lys Asn His Ala Ile Tyr Glu Lys Ala Lys Glu Val Ser Ser Ala565 570 575Leu Ser Lys Val Leu Ser Lys Ile Asp Asp Thr Ser Ala Glu Leu Leu580 585 590Thr Asp Asp Ile Ser Asp Leu Lys Asn Asn Asn Asp Ile Thr Ala Glu595 600 605Asn Asn Asn Ile Tyr Lys Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr Ser Leu Ser610 615 620Lys Val Leu Lys Asn Ile Asn Lys Asp625 630<210>2<211>580<212>PRT<213>志賀氏菌屬(Shigella)
<400>2Met His Asn Val Ser Thr Thr Thr Thr Gly Leu Pro Leu Ala Lys Ile1 5 10 15Leu Ala Ser Thr Glu Leu Gly Asp Asn Thr Ile Gln Ala Ala Asn Asp20 25 30Ala Ala Asn Lys Leu Phe Ser Leu Thr Ile Ala Asp Leu Ala Ala Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Thr Thr Asn Ala His Ser Thr Ser Asn Ile Leu Ile50 55 60Pro Glu Leu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Asn Ala Ser Ser Gln Leu Thr65 70 75 80Leu Leu Ile Gly Asn Leu Ile Gln Ile Leu Gly Glu Lys Ser Leu Thr85 90 95Ala Leu Thr Asn Lys Ile Thr Ala Trp Lys Ser Gln Gln Gln Ala Arg100105110Gln Gln Lys Asn Leu Glu Phe Ser Asp Lys Ile Asn Thr Leu Leu Ser115120125Glu Thr Glu Gly Leu Thr Arg Asp Tyr Glu Lys Gln Ile Asn Lys Leu130135140Lys Asn Ala Asp Ser Lys Ile Lys Asp Leu Glu Asn Lys Ile Asn Gln145150155160Ile Gln Thr Arg Leu Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ser Pro Glu Asn Lys165170175Lys Leu Arg Arg Glu Glu Ile Gln Leu Thr Ile Lys Lys Asp Ala Ala180 185190Val Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys Thr Leu Ser Ile His Ser195 200 205Lys Leu Thr Asp Lys Ser Met Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Ser Arg210 215 220Lys Thr Glu Met Glu Arg Lys Ser Asp Glu Tyr Lys Glu Ile Asp Ser225 230 235 240Phe Ser Ala Phe Ser Asn Thr Ala Ser Ala Glu Gln Leu Ser Thr Gln
245 250 255Gln Lys Ser Leu Thr Gly Leu Ala Ser Val Thr Gln Leu Met Ala Thr260 265 270Phe Ile Gln Leu Val Gly Lys Asn Asn Glu Glu Ser Leu Lys Asn Asp275 280 285Leu Ala Leu Phe Gln Ala Ala Glu Val Arg Lys Ala Glu Glu Leu Asn290 295 300Arg Val Met Gly Cys Val Gly Lys Ile Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ile305 310 315 320Val Ser Val Val Ala Ala Ala Phe Ser Gly Gly Ala Ser Leu Ala Leu325 330 335Ala Ala Val Gly Leu Ala Leu Met Val Thr Asp Ala Ile Val Gln Ala340 345 350Ala Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Gln Ala Leu Asn Pro Ile Met Lys355 360 365Ala Val Ile Glu Pro Leu Ile Lys Leu Leu Ser Asp Ala Phe Thr Lys370 375 380Met Leu Glu Gly Leu Gly Val Asp Ser Lys Lys Ala Lys Met Ile Gly385 390 395 400Ser Ile Leu Gly Ala Ile Ala Gly Ala Leu Val Leu Val Ala Ala Val405 410 415Val Leu Val Ala Thr Val Gly Lys Gln Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu420 425 430Asn Ile Gly Lys Ile Ile Gly Lys Thr Leu Thr Asp Leu Ile Pro Lys435 440 445Phe Leu Lys Asn Phe Ser Ser Gln Leu Asp Asp Leu Ile Thr Asn Ala450 455 460Val Ala Arg Leu Asn Lys Phe Leu Gly Ala Ala Gly Asp Glu Val Ile465 470 475 480Ser Lys Gln Ile Ile Ser Thr His Leu Asn Gln Ala Val Leu Leu Gly485 490 495Glu Ser Val Asn Ser Ala Thr Gln Ala Gly Gly Asn Val Ala Ser Ala
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<210>4<211>332<212>PRT<213>志賀氏菌屬(Shigella)<400>4Met Asn Ile Thr Thr Leu Thr Asn Ser Ile Ser Thr Ser Ser Phe Ser1 5 10 15Pro Asn Asn Thr Asn Gly Ser Ser Thr Glu Thr Val Asn Ser Asp Ile20 25 30Lys Thr Thr Thr Ser Ser His Pro Val Ser Ser Leu Thr Met Leu Asn35 40 45Asp Thr Leu His Asn Ile Arg Thr Thr Asn Gln Ala Leu Lys Lys Asp50 55 60Leu Ser Gln Lys Thr Leu Thr Lys Thr Ser Leu Glu Glu Ile Ala Leu65 70 75 80His Ser Ser Gln Ile Ser Met Asp Val Asn Lys Ser Ala Gln Leu Leu85 90 95Asp Ile Leu Ser Lys Lys Glu Tyr Pro Ile Asn Lys Asp Ala Arg Glu100 105 110Leu Leu His Ser Ala Pro Lys Glu Ala Glu Leu Asp Gly Tyr Glu Met115 120 125Ile Ser His Arg Glu Leu Trp Asp Lys Ile Ala Lys Ser Ile Asn Asn130 135 140Ile Asn Glu Gln Tyr Leu Lys Val Tyr Glu His Ala Val Ser Ser Tyr145 150 155 160Thr Gln Met Tyr Gln Asp Phe Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Ala Gly165 170 175Trp Ile Ser Pro Gly Gly Asn Asp Gly Asn Ser Val Lys Leu Gln Val180 185 190Lys Ser Leu Lys Asp Glu Leu Thr Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Lys Asp
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權(quán)利要求
1.一種痢疾多價(jià)基因工程菌苗，它的活性成分是既表達(dá)侵襲蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS-0多糖抗原的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌苗，其特征在于所述痢疾多價(jià)基因工程菌苗的生產(chǎn)培養(yǎng)基為pH為6.5-7.6的厚氏培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌苗，其特征在于所述生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH為7.2-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的菌苗，其特征在于所述痢疾多價(jià)基因工程菌苗的劑型為膠囊口服劑型或滴鼻劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌苗，其特征在于所述劑型的痢疾多價(jià)基因工程菌苗采用凍干法進(jìn)行制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌苗，其特征在于在制備所述劑型的痢疾多價(jià)基因工程菌苗過程中所采用的凍干保護(hù)劑為pH7.0-7.6的含有0.5％明膠，5％蔗糖、0.2％維生素C、0.1％谷維素、0.1％脫脂奶粉的磷酸緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量質(zhì)量百分含量。
7.一種制備權(quán)利要求1所述痢疾多價(jià)基因工程菌苗株的方法，包括以下步驟1)將含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到福氏痢疾桿菌2a型II中，得到含有所述I相質(zhì)粒的重組福氏痢疾桿菌2a型II；2)將含有所述I相質(zhì)粒的重組福氏痢疾桿菌2a型II中的aroD基因缺失，得到既表達(dá)侵襲蛋白抗原IpaA、IpaB、IpaC和IpaD，又表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS-O多糖抗原的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒來自于宋內(nèi)氏痢疾菌毒株48025-11或宋內(nèi)氏痢疾菌株S63。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述含有侵襲蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相質(zhì)粒通過誘動(dòng)質(zhì)粒R386轉(zhuǎn)移到福氏痢疾桿菌2a型II中；所述誘動(dòng)質(zhì)粒R386來自于E.coli。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述福氏痢疾桿菌2a型II為福氏痢疾桿菌2a型II T32菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種痢疾多價(jià)基因工程菌苗。本發(fā)明所提供的痢疾多價(jià)基因工程菌苗，它的活性成分是既表達(dá)侵襲蛋白抗原IpaA、IpaB、IpaC和IpaD，又表達(dá)福氏和宋內(nèi)氏雙價(jià)LPS－O多糖抗原的痢疾多價(jià)基因工程菌苗株。經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠、豚鼠、家兔和猴)滴鼻或口服途徑免疫，證明本發(fā)明的痢疾多價(jià)基因工程菌苗有很好的多價(jià)免疫原性，可保護(hù)免疫小鼠、猴有效抵抗S.F2a及S.sonnei毒株的攻擊，并以經(jīng)大量動(dòng)物和人群觀察證明比痢疾雙價(jià)基因工程菌苗免疫劑量降低100倍以上，并且免疫保護(hù)效果明顯提高，及能有效誘導(dǎo)粘膜多價(jià)特異抗體反應(yīng)，可提供多價(jià)保護(hù)，并可進(jìn)行大量生產(chǎn)，可有效預(yù)防細(xì)菌性痢疾。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1912106SQ20051008985
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者王希良, 邢麗, 羅德炎, 張松樂, 王棟, 江海燕, 楊海榮, 張良艷, 高杰英 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所