專利名稱：一種新穎的粒細(xì)胞制備及其抗癌活性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化粒細(xì)胞的方法，特別是一種新型的不損傷粒細(xì)胞活性的制備方法與抗癌活性檢測(cè)方法(cancer-killing assay, CKA)。
背景技術(shù)：
目前，癌癥已成為人類健康的第一殺手，奪走了千千萬(wàn)萬(wàn)人的寶貴生命。根椐世界衛(wèi)生組織最新資料顯示，在全球近66億人口中，每年新發(fā)腫瘤病人約有1000萬(wàn)，約有500多萬(wàn)人死于癌癥，幾乎每6秒鐘就有一名癌癥患者死亡。它的可怕性不僅在于疾病對(duì)患者機(jī)體組織的嚴(yán)重破壞和癌癥患者的高死亡率，而且在于傳統(tǒng)療法，如放療、化療等帶來(lái)的難以忍受的副作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)治療癌癥的研究雖然取得了階段性成果，但治療癌癥的方法和效果還是不盡如人意，仍然無(wú)法找到對(duì)癌癥形成有效殺傷、清除和減低副作用的治療方法。1999年，我公司首席科學(xué)家崔征教授及其研發(fā)團(tuán)隊(duì)意外發(fā)現(xiàn)了一只具有超強(qiáng)抗癌活性的小白鼠。這只小白鼠經(jīng)受了大量多種惡性程度極高癌細(xì)胞的考驗(yàn)并保持了完美健康及超強(qiáng)的生育能力。而且這種天然抗癌能力由遺傳因素決定并以顯性方式傳代。更為意外的發(fā)現(xiàn)是，這種天然抗癌能力完全是由自然免疫體系里的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞執(zhí)行的。迄今這只小白鼠已繁殖了幾千只 具有同樣抗癌活性的子孫后代。將抗癌小鼠的粒細(xì)胞提供給患晚期癌癥小鼠后，患晚期癌癥小鼠痊愈，取得了極佳療效。通過(guò)抗癌小白鼠的提示，崔教授及其團(tuán)隊(duì)近年來(lái)對(duì)人群進(jìn)行了大量的研究并發(fā)現(xiàn)一部分健康年青人的粒細(xì)胞內(nèi)也天然存有類似的超強(qiáng)抗癌活性。粒細(xì)胞是人體循環(huán)血里白血球中的主要成分,約占白血球總數(shù)的50%-70%。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為粒細(xì)胞的功能只限于抗細(xì)菌。崔教授的發(fā)現(xiàn)顯示粒細(xì)胞可為人體提供天然免疫監(jiān)控。粒細(xì)胞可以不斷及時(shí)清除新產(chǎn)生的癌細(xì)胞。癌癥的產(chǎn)生很可能是由于粒細(xì)胞免疫監(jiān)控活性降低使癌細(xì)胞得不到及時(shí)清除而大量堆積。粒細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞有極高的靶向性和鑒別能力。這種天然的鑒別能力并不是基于細(xì)胞表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)而是基于細(xì)胞表面的電荷。粒細(xì)胞的殺傷力是來(lái)自于胞漿顆粒中的正電多肽。粒細(xì)胞的靶向是帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜。因?yàn)閹缀跞看罅科咸烟菬o(wú)氧酵解，癌細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量乳酸。大量乳酸的釋放會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞表面丟失大量正電荷而顯負(fù)電。正常細(xì)胞由于靠葡萄糖有氧降解來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞能量從而表面顯電中性。粒細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后，即釋放正電多肽在靶細(xì)胞膜上打孔從而殺死靶細(xì)胞。據(jù)此科研成果，崔征教授發(fā)明并提出了提高抗癌免疫力的獨(dú)特方法——“粒細(xì)胞成分輸血提高抗癌免疫力療法”，我們稱之為“粒福特療法”。全新概念的療法可利用新開(kāi)發(fā)的檢測(cè)技術(shù)-CKA去尋找有超級(jí)抗癌活性的健康人供體。然后用成分采血成分輸血的方法把有特異抗癌活性的粒細(xì)胞輸給病人進(jìn)行治療。粒細(xì)胞天然抗癌活性的檢測(cè)方法及原理參見(jiàn)附圖1。粒細(xì)胞天然抗癌活性的檢測(cè)方法及原理
發(fā)明內(nèi)容
眾所周知，粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成成分，具有抗癌活性，活性高的粒細(xì)胞能夠殺死癌細(xì)胞，而很多人粒細(xì)胞抗癌活性降低，抗癌免疫力不足，因而患上癌癥。通過(guò)我公司自主研發(fā)的新技術(shù)，制備得到高純度的粒細(xì)胞，嚴(yán)格篩選出健康人具有殺死癌細(xì)胞能力的粒細(xì)胞。(和病人配型成功后，再將粒細(xì)胞以成分輸血的方式輸入癌癥患者體內(nèi)，粒細(xì)胞進(jìn)入癌癥患者體內(nèi)后，就會(huì)發(fā)揮自己的功效，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行靶向性追殺，好似精確制導(dǎo)導(dǎo)彈一般對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行“制導(dǎo)式轟炸”，從而達(dá)到殺死癌細(xì)胞的作用。)本發(fā)明的目的是提供一種分離純化粒細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種新穎的粒細(xì)胞抗癌活性的檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一目的是提供CKA的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離純化粒細(xì)胞的方法，該方法的制備工藝流程見(jiàn)附圖2。具體敘述如下:(I)采集健康成年人外周血2ml ； (2)于冰盒中迅速送至CKA檢測(cè)中心；(3)按照全血:沉淀液(LIFT-001) = 5: I (v/v)的比例加入沉淀液；于_41:靜置10分鐘；(4)使用新穎的細(xì)胞分離純化液LIFT-002，用純化水配制成3個(gè)不同的濃度，將上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)先加有分離純 化液的15ml離心管中；5000g離心60分鐘；(5)取白膜層。技術(shù)路線如下:1.沉淀紅細(xì)胞使用本公司自制的沉淀液(LIFT-001)，按照血液:沉淀液=5: I (v/v)的比例混合，靜置90分鐘。期間搖晃3次。2.配制分離純化液LIFT-002分離液配制3種密度粒細(xì)胞分離液各40ml，如有誤差，進(jìn)行調(diào)整。用0.22 μ m無(wú)菌過(guò)濾器負(fù)壓吸引過(guò)濾除菌,分裝于15ml無(wú)菌離心管中，IOml/管。3.粒細(xì)胞的制備(I)取I支15ml離心管，按照粒細(xì)胞分離液1、2、3的順序分別加入3種不同比重分離液，每種分離液加入2ml，總體積6ml。將步驟I得到的上清層小心加入15ml離心管分離液的上層界面。(2)室溫5000g離心，60分鐘。(3)用移液器吸出上層血漿和分離液之間的細(xì)胞，移入I支新離心管待用。加入5ml完全培養(yǎng)基(CM)，計(jì)數(shù)，待用，即為效應(yīng)細(xì)胞。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種新穎的中性粒細(xì)胞抗癌活性的檢測(cè)方法。其技術(shù)路線詳述如下:1.接種腫瘤細(xì)胞(I)將Hela細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中在37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加PBS清洗細(xì)胞，加胰酶消化細(xì)胞，加培養(yǎng)基終止胰酶消化。(3)調(diào)細(xì)胞濃度，將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板相應(yīng)孔中，在37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。2.加入粒細(xì)胞粒細(xì)胞的殺傷功能是一個(gè)多步驟、多部件及高協(xié)調(diào)性的整體細(xì)胞過(guò)程，其中包括趨化作用、效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的相互識(shí)別、及粒細(xì)胞的脫顆粒殺傷靶細(xì)胞。將本發(fā)明的第一方面得到的白膜層按照一定比例和腫瘤細(xì)胞孵育12小時(shí)。3.觀察與檢測(cè)使用實(shí)時(shí)細(xì)胞監(jiān)控系統(tǒng)監(jiān)測(cè)粒細(xì)胞的殺癌活性。使用LIFT-003試劑配方檢測(cè)粒細(xì)胞殺傷活性。在本發(fā)明的第三方面是CKA的用途。如上所述，在臨床上，用本發(fā)明所述的CKA方法嚴(yán)格篩選出健康人具有殺死癌細(xì)胞能力的粒細(xì)胞，和病人配型成功后，再將粒細(xì)胞以成分輸血的方式輸入癌癥患者體內(nèi)， 粒細(xì)胞進(jìn)入癌癥患者體內(nèi)后，就會(huì)發(fā)揮自己的功效，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行靶向性追殺，好似精確制導(dǎo)導(dǎo)彈一般對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行“制導(dǎo)式轟炸”，從而達(dá)到殺死癌細(xì)胞的作用。有望對(duì)腫瘤患者進(jìn)行有效的治療。


圖1，粒細(xì)胞天然抗癌活性的檢測(cè)方法及原理。圖2，一種分離純化粒細(xì)胞的制備工藝流程圖。圖3，沉降紅細(xì)胞。圖4，分離純化粒細(xì)胞。圖5，CKA實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)觀察圖(粒細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞)。
圖6，CKA實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式材料:(I)細(xì)胞株Hela腫瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。(2)酶和試劑:LIFT-001，公司自有配方配制。LIFT-002，公司自有配方配制。(3)培養(yǎng)基:Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自上海生工。方法粒細(xì)胞殺癌活性的測(cè)定:參見(jiàn)Cui, Z.，Willingham, M.C.，Hicks, A.Μ.，Alexander-Miller, M.A., Howard, T.D., Hawkins, G.A., Miller, M.S., Weir, H.M., Du, ff.&DeLong, C.J.(2003)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 100，6682-6687 方法進(jìn)行。實(shí)施例1:接種腫瘤細(xì)胞(I)將IX IO4個(gè)Hela細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，每瓶3.5ml完全培養(yǎng)基。(2)在37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加5-10毫升PBS清洗細(xì)胞，吸棄PBS。加5毫升0.25%的胰酶消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓，加5ml培養(yǎng)基終止胰酶消化，用吸管將細(xì)胞移入15ml離心管，取0.1毫升做臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。(4)調(diào)細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/ml，將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板相應(yīng)孔中200 μ I/孔，150 μ I/孔，100 μ I/孔，50 μ I/孔，3復(fù)孔。其余各實(shí)驗(yàn)孔加培養(yǎng)基。96孔板周邊各孔加滿
生理鹽水。7)在37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12hr。實(shí)施例2:外周血的采集與紅細(xì)胞的沉淀無(wú)菌采集供血者 外周血2ml，肝素抗凝，在采血管上填寫供血者相關(guān)信息。使用本公司研制的沉淀液(LIFT-001)配方，按照血液:沉淀液=5: I (v/v)的比例混合，靜置90分鐘。期間搖晃3次。實(shí)施例3粒細(xì)胞的制備使用我公司研制的LIFT-002分離液配方配制3種密度粒細(xì)胞分離液各50ml
] 立細(xì)胞分離液名稱粒細(xì)胞分離母液A 粒細(xì)胞分離母液B 粒細(xì)胞分離母液C
粒細(xì)胞分離液I30__5__15_
立細(xì)胞分離液226618"
立細(xì)胞分離液3 I 217I 22(I)取3支50ml無(wú)菌離心管，分別標(biāo)為1，2，3分別對(duì)應(yīng)粒細(xì)胞分離液1-3。(2)將各離心管放在天平上分別稱重，記錄各管的重量。(3)按照上表標(biāo)注的量分別往1-3號(hào)離心管中加入粒細(xì)胞分離母液C和B，輕輕搖勻。然后再分別加入粒細(xì)胞分離母液A，用吸管混勻。(4)再將各離心管放在天平上分別稱重，分別減去各自空管的重量，與表中對(duì)應(yīng)的重量進(jìn)行對(duì)比，如有誤差，進(jìn)行調(diào)整。(5)用0.22 μ m無(wú)菌過(guò)濾器負(fù)壓吸引過(guò)濾除菌,分裝于15ml無(wú)菌離心管中，IOml/管，標(biāo)簽注明分離液名稱，配制日期。(6)取I支15ml離心管，按照粒細(xì)胞分離液1、2、3的順序分別加入3種不同比重分離液，每種分離液加入2ml，總體積6ml。無(wú)菌采集供血者外周血2ml，肝素抗凝，將步驟I得到的上清層小心加入15ml離心管分離液的上層界面。(7)室溫5000g離心，60分鐘。(8)用巴斯德吸管小心吸出上層血漿和分離液之間的細(xì)胞，移入I支新離心管待用。(9)加入Iml完全培養(yǎng)基(CM)，計(jì)數(shù)，用CM調(diào)整粒細(xì)胞濃度為5X104/ml，即為效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)施例4CKA殺傷實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)箱中取出96孔板，用負(fù)壓吸引器吸去各孔培養(yǎng)液。根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞=100: 1,50: 1,1: I分別向已加入靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔中加入相應(yīng)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，設(shè)相應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和只培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔，每孔培養(yǎng)基終體積100 μ 1，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37°C ,5% CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。用實(shí)時(shí)細(xì)胞監(jiān)控系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，拍照。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取出96孔培養(yǎng)板，用真空泵將未貼壁細(xì)胞吸棄。每孔加入100 μ I檢測(cè)試劑LIFT-003。在37 °C，5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。在酶標(biāo)儀上用570 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度(A值)，計(jì)算出3個(gè)復(fù)孔的平均值。計(jì)算殺傷率:1-〔 A (效卿胞+ IG細(xì)胞廠A對(duì)照/A ι 細(xì)胞對(duì)照-A對(duì)照〕X 100%抗癌活性的檢測(cè)具有以下意義:1.將會(huì)篩選出高活性的高效供體。2.抗癌活性的檢測(cè)可用于癌癥預(yù)防及危險(xiǎn)因素的管理。例如，早期發(fā)現(xiàn)抗癌活性降低可早期采取一些恢復(fù)措施或早期檢查。這一點(diǎn)很類似于檢測(cè)膽固醇在預(yù)防心血管疾病中的地位。3.抗癌活性的檢測(cè)方法可用來(lái)篩選可提高抗癌活性的化合物及營(yíng)養(yǎng)品。4.本發(fā)明基于的理念是最好的抗癌藥劑是自身的健康的有抗癌活性的粒細(xì)胞。如果年青時(shí)把自身健康的粒細(xì)胞液氮冷藏下來(lái)，這將為抗癌和抗 衰老的實(shí)踐提供前所未有的、令人鼓舞的手段。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)血液中粒細(xì)胞抗癌活性(cancer-killing assay, CKA)的方法,包括血液的采集及其粒細(xì)胞的分離純化和活性檢測(cè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的CKA，其特征是血液是外周血，可采集自健康成年人，也可采集自癌癥患者。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的CKA，其特征是細(xì)胞是粒細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的CKA，其特征是粒細(xì)胞是外周全血中分離的單細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于一步法分離純化得到粒細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的制備方法，分離純化所用的試劑與溶液對(duì)粒細(xì)胞的活性沒(méi)有損傷。
7.按照權(quán)利要求1所述的CKA，其特征在于既可單獨(dú)使用也可與藥物載體組合制成藥物組合物。
8.按照權(quán)利要求1所述的CKA，其特征在于既可單獨(dú)使用也可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
9.一種檢測(cè)血液中粒細(xì)胞抗癌活性的方法，包括步驟:(I)由執(zhí)業(yè)護(hù)士采集健康成年人或癌癥患者的外周血2ml ;(2)放入冰盒，迅速送至CKA檢測(cè)中心；(3)按照全血:沉淀液= 5:1 (v/v)的比例加入沉淀液；于_4°C靜置10分鐘；(4)將上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)先加有分離純化液的15ml離心管中；5000g離心60分鐘；(5)取中間的一層白膜層；(6)按照一定比例將得到的粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞孵育12小時(shí)，檢測(cè)粒細(xì)胞的殺癌活性。
10.本發(fā)明中提供的CKA方法適用于人體和動(dòng)物的血液中得到的粒細(xì)胞對(duì)各種腫瘤細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)，也適用于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的制備及其活性的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離純化粒細(xì)胞的方法，特別是一種新型的不損傷粒細(xì)胞活性的制備方法與抗癌活性檢測(cè)方法(cancer-killing assay，CKA)。采集供血者外周血2ml，肝素抗凝。使用本公司研制的沉淀液(LIFT-001)配方，按血液∶沉淀液＝5∶1(v/v)混合。然后將上清液轉(zhuǎn)移到加有LIFT-002的離心管中，離心，取白膜層。加入培養(yǎng)基計(jì)數(shù)即為效應(yīng)細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞孵育進(jìn)行CKA檢測(cè)。CKA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有的健康成年人的粒細(xì)胞能有效地殺死Hela腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)結(jié)果表明癌細(xì)胞被粒細(xì)胞破碎殺傷?？拱┗钚詸z測(cè)可篩選出高活性的高效供體并用于癌癥預(yù)防、治療及危險(xiǎn)因素的管理。
文檔編號(hào)C12N5/0787GK103215340SQ20121001630
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者王申俊, 崔征 申請(qǐng)人:江蘇粒福特生物科技有限公司