專利名稱：：柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是果實(shí)采后病害防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的是一種柑橘果實(shí)生物防腐保鮮技術(shù)。
背景技術(shù)：
我國(guó)柑橘種植面積2008年已達(dá)3046.2萬(wàn)畝，產(chǎn)量2331.3萬(wàn)噸，柑橘種植總面積和總產(chǎn)量居世界第一。我國(guó)柑橘的成熟期較為集中，主要在9-12月份，以鮮銷為主，旺季時(shí)大量柑橘需貯藏保鮮，但柑橘在采后貯藏運(yùn)輸過(guò)程中由于真菌侵染造成的病害腐爛嚴(yán)重，導(dǎo)致大量的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘采后由真菌引起的病害主要有指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、酸腐(GeotrichumCandidum)、蒂腐病(Stem-endrot)等。其中以指狀青霉(Penicilliumdigitatum)引起的柑橘綠霉病是柑橘采后最嚴(yán)重的病害之一。目前市場(chǎng)上控制果實(shí)病害主要靠化學(xué)殺菌劑，長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑，一些病原菌還進(jìn)化產(chǎn)生了抗藥性菌種，目前允許使用的化學(xué)殺菌劑的效果也越來(lái)越差，并且殺菌劑在柑橘表面的殘留量較大。柑橘是世界第一大類水果，年貿(mào)易額超過(guò)65億美元。目前我國(guó)鮮果和以橘片罐頭為主的柑橘制品出口量很低，年出口量不到年總產(chǎn)量的5%，遠(yuǎn)低于世界柑橘出口10%左右的平均值，近年來(lái)世界主要柑橘生產(chǎn)大國(guó)巴西和美國(guó)的種植面積和產(chǎn)量都在逐步萎縮，我國(guó)柑橘出口產(chǎn)量仍有很大的上升空間。影響中國(guó)柑橘出口的因素較多，其中國(guó)際上的檢疫壁壘和以農(nóng)藥殘留、重金屬殘留設(shè)限的“綠色壁壘”成為制約我國(guó)柑橘出口的最主要因素。目前各國(guó)對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注日益提高，對(duì)柑橘的檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)逐漸提高，以及國(guó)內(nèi)柑橘市場(chǎng)產(chǎn)品質(zhì)量的要求提高，因此迫切需要開(kāi)發(fā)能替代學(xué)殺菌劑的果實(shí)病害的控制方法和技術(shù)。利用生物或非生物激發(fā)子預(yù)先處理果蔬產(chǎn)品而誘導(dǎo)果蔬產(chǎn)品對(duì)隨后貯藏或運(yùn)輸途徑中所遭受到的病原菌侵染產(chǎn)生自然抗性免疫反應(yīng)，通過(guò)果蔬產(chǎn)品自身抗病防御系統(tǒng)的活化而有效抵御或殺死病原菌的防治方法近年來(lái)引起了人們的極大研究熱情，成為采后病害控制研究的熱點(diǎn)之一。近十年來(lái)，利用微生物進(jìn)行生物防治取得了突破性的進(jìn)展，被認(rèn)為是最有希望的替代化學(xué)殺菌劑的方法之一，特別是酵母在果蔬采后病害生物防治的應(yīng)用研究。但目前單獨(dú)使用拮抗酵母對(duì)病原菌的控制效力與化學(xué)殺菌劑相比還存在較大差距，而單獨(dú)使用非生物激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)對(duì)病害的控制效力遠(yuǎn)不如化學(xué)殺菌劑，因此如何利用安全有效的方法提高生防酵母的生防效力或通過(guò)結(jié)合應(yīng)用安全有效的方法提高對(duì)病原菌的拮抗效力，成為研究可替代化學(xué)殺菌劑的果實(shí)病害有效安全的控制方法和技術(shù)的重要熱點(diǎn)領(lǐng)域。羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)是國(guó)內(nèi)外較廣泛研究的應(yīng)用于果蔬采后生物防治的拮抗微生物菌株。研究結(jié)果報(bào)道其主要拮抗機(jī)理為營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)果實(shí)抗性反應(yīng)、分泌P-I,3-葡聚糖酶等。Roberts(1990)報(bào)道羅倫隱球酵母對(duì)蘋果采后的灰霉和綠霉病害有抑制效果。劉海波、田世平(2002)報(bào)道利用羅倫隱球酵母能夠有效抑制葡萄采后的發(fā)病率；鄭曉冬、張紅印(2003)報(bào)道羅倫隱球酵母對(duì)草莓采后由灰葡萄孢霉引起的灰霉腐爛有較好的抑制效果。YuT等(2008)報(bào)道經(jīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)處理后的羅倫隱球酵母可顯著提高其對(duì)采后梨果由擴(kuò)展青霉引起青霉病的拮抗效力。MengXH等(2010)報(bào)道采前噴灑羅倫隱球酵母結(jié)合采后殼聚糖披膜可顯著提高葡萄的抗病性，降低其腐爛率。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00310115336.4(一種生物拮抗菌及其應(yīng)用)公開(kāi)了一種生物拮抗菌及其應(yīng)用，此發(fā)明所提供的生物拮抗菌，是羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii(Kuffer.)Skinner)BAY-3CGMCCNo1029,能有效防治果蔬米后的主要病害。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00910078858.9(葡萄果實(shí)采后病害或果粒脫落的防治方法及其專用防治劑)公開(kāi)了一種葡萄果實(shí)采后病害或果粒脫落的防治方法及其專用防治劑。該方法包括將采摘后的葡萄用下述I)或2)的物質(zhì)進(jìn)行處理的過(guò)程1)硼酸鹽；2)硼酸鹽和生物殺菌劑。該硼酸鹽的使用濃度可為0.II%，該生物殺菌劑的使用濃度可為IXIO4-IXIO9CFU羅倫隱球酵母菌(Cryptococcuslaurentii)/ml的菌液。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00910079774.7(一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法)公開(kāi)了一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法。此發(fā)明的制備隱球酵母屬菌膠囊劑的方法，包括如下步驟將褐藻酸鹽溶液、隱球酵母屬菌、多價(jià)金屬陽(yáng)離子混合，得到隱球酵母屬菌膠囊齊U。此方法制備得到的隱球酵母屬菌膠囊劑中活菌率高，均在70%以上，高的可達(dá)90%，而且菌的活性不會(huì)下降。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010152108.4(桃果實(shí)病害生物防腐保鮮劑及用途和所用羅倫隱球酵母)公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母，保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10。同時(shí)公開(kāi)了一種桃果實(shí)病害生物防腐保鮮劑,其由羅倫隱球酵母懸浮液、殼聚糖、氯化鈣和水組成，還同時(shí)公開(kāi)了利用上述防腐保鮮劑所進(jìn)行的桃果實(shí)保鮮法，能有效延長(zhǎng)桃果實(shí)的保鮮時(shí)間。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010173206.6(果實(shí)病害防腐保鮮劑)公開(kāi)了一種果實(shí)病害防腐保鮮劑，其由羅倫隱球酵母懸浮液、嘧霉胺和水組成，每IL保鮮劑中含有IX101°IXIO11個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞、4400mg嘧霉胺，其余為水，該果實(shí)病害防腐保鮮劑具有防腐效果好的特點(diǎn)。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010202937.9(防治果實(shí)青霉病的生物防腐保鮮劑)公開(kāi)了一種防治果實(shí)青霉病的生物防腐保鮮劑，其由羅倫隱球酵母懸浮液、殼聚糖、氯化鈣、水楊酸和水組成，每IL保鮮劑中含有IXIO9IXIO11個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞、0.52g的殼聚糖、1020g的氯化鈣和220mg的水楊酸，其余為水。該生物防腐保鮮劑能有效控制果實(shí)的青霉病。茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)是一種包含于素馨花(JasminumgrandiforumL.)及迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)精油中的揮發(fā)性化合物，其作為一種天然存在的揮發(fā)性植物激素普遍存在于各種植物中。MeJA具有多種生理功能，其對(duì)植物在病害及逆境下抗性的誘導(dǎo)得到廣泛關(guān)注。目前研究報(bào)道，采用適當(dāng)濃度的外源MeJA處理果蔬，可誘導(dǎo)提高果蔬的抗性，減少采后果蔬病害腐爛的發(fā)生。MeJA作為植物抗性的激發(fā)子，其誘導(dǎo)采后果蔬抗病性的機(jī)制主要在于誘導(dǎo)果蔬抗性酶活性的提高、誘導(dǎo)次級(jí)代謝物質(zhì)含量的上升以及病程相關(guān)蛋白的表達(dá)。DrobyS等(1999)發(fā)現(xiàn)用MeJA處理葡萄柚后可顯著抑制其綠霉病的發(fā)生。YaoHJ等(2005)在應(yīng)用MeJA處理桃果、甜櫻桃后可顯著抑制其發(fā)病腐爛。PengJin等(2009)發(fā)現(xiàn)經(jīng)MeJA處理后桃其青霉病、灰霉病及軟腐病的發(fā)病情況得到顯著抑制。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010500108.9(—種枇杷果實(shí)熱空氣和MeJA復(fù)合處理保鮮方法)公開(kāi)了一種枇杷果實(shí)熱空氣和MeJA復(fù)合處理保鮮方法，專用于枇杷果實(shí)采后貯運(yùn)過(guò)程中冷害的控制和品質(zhì)的保持，以延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。該技術(shù)將挑選預(yù)冷后的枇杷果實(shí)置于一定體積的密閉容器，在38°C熱空氣中用15-20iimOl/LMeJA熏蒸6小時(shí)，該復(fù)合處理保鮮方法可顯著抑制枇杷果實(shí)采后冷害和品質(zhì)劣變；其技術(shù)為“熱空氣處理和MeJA處理”兩者的結(jié)合處理，其主要目的在于減少枇杷果實(shí)冷害的癥狀。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00810220332.5(茉莉酸甲酯在蔬菜保鮮方面的應(yīng)用以及浸種溶液)公開(kāi)了茉莉酸甲酯在蔬菜保鮮方面的應(yīng)用以及浸種溶液。茉莉酸甲酯可應(yīng)用于蔬菜種子播種前進(jìn)行浸種處理；同時(shí)提供了一種蔬菜保鮮浸種溶液，為茉莉酸甲酯的水溶液，茉莉酸甲酯的濃度為0.001umol.L—11000umol.L'此發(fā)明用很低濃度的茉莉酸甲酯水溶液浸泡菜心種子，并用這樣的種子播種生產(chǎn)菜心，就可以達(dá)到提高菜心可溶性固形物和維生素C含量、提高菜心新鮮度、減輕采后菜心發(fā)病腐爛率、延長(zhǎng)菜心保鮮壽命的目的。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010113769.6(通過(guò)茉莉酸甲酯處理提高青蒿中青蒿素含量的方法)公開(kāi)了一種通過(guò)茉莉酸甲酯處理提高青蒿中青蒿素含量的方法。中國(guó)國(guó)家發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01010505970.9(利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法)公開(kāi)了一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，能大幅縮短雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅的時(shí)間，并顯著增加蝦青素產(chǎn)量，從而大大提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的效率。參考文獻(xiàn)具體如下I、Roberts,R.G.PostharvestbiologicalcontrolofgraymoldofapplesbyCryptococcuslaurentii.Phytopathology,1990,80526-530(羅伯茨，R.G.應(yīng)用羅倫隱球酵母對(duì)釆后蘋果灰霉病的生物防治，植物病理學(xué)，1990,80:526-530)。2、劉海波，田世平，秦國(guó)政，徐勇.羅倫隱球酵母對(duì)葡萄釆后病害的拮抗效果，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，(07)o3、鄭曉冬，張紅印，席珣芳..農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2003，(05)。4、YuTjWangLPjYinY，etal.EffectofchitinontheantagonisticactivityofCryptococcuslaurentiiagainstPenicilliumexpansuminpearfruit.INTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY，2008，122，(1-2):44-48(余、王、殷等，甲殼素對(duì)羅倫隱球酵母拮抗梨果實(shí)上擴(kuò)展青霉的效力影響，國(guó)際食品微生物雜志，2008，122，(1-2):44-48)。5、MengXHjQinGZjTianSP.InfluencesofpreharvestsprayingCryptococcuslaurentiicombinedwithpostharvestchitosancoatingonpostharvestdiseasesandqualityoftablegrapesinstorage.LWT-F00DSCIENCEANDTECHNOLOGY，2010，43(4):596-601(孟、秦、田等，釆前噴灑羅倫隱球酵母結(jié)合釆后殼聚糖涂膜處理對(duì)鮮食葡萄釆后病害及品質(zhì)的影響，LWT-食品科學(xué)與技術(shù)，2010，43(4)596-601)o6、DrobyS，PoratR,CohenL,WeissB，ShapioB，Philosoph-HadasS，etal,Suppressinggreenmolddecayingrapefruitwithpostharvestjasmonateapplication.AmSocHortScij1999，124:184-188.(爵勞比等，釆后應(yīng)用茉莉酸抑制柚子綠霉腐爛，美國(guó)社會(huì)園藝學(xué)，1999，124:184-188.)。7、PengJin,YonghuaZheng,ShuangshuangTang,etal,Enhancingdiseaseresistanceinpeachfruitwithmethyljasmonate.Journalofthescienceoffoodandagriculture,2009，89:802-808(金、鄭等,應(yīng)用茉莉酸甲酯處理提高桃果實(shí)抗病性,食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,89:802-808)。8、YaoHJandTianSPjEffectsofabiocontrolagentandmethyljasmonateonpostharvestdiseaseofpeachfruitandthepossiblemechanisminvolved.ApplMicrobiol,2005,98:941-950(姚、田，生防菌和茉莉酸甲酯對(duì)釆后桃果實(shí)病害的影響及其可能機(jī)制，應(yīng)用微生物學(xué)，2005，98:941-950)。9、HongjieYaojShipingTian.Effectsofpre-andpost-harvestapplicationofsalicylicacidormethyljasmonateoninducingdiseaseresistanceofsweetcherryfruitinstorage.PostharvestBiologyandTechnology，2005,35:253-262(姚、田，采前和采后應(yīng)用水楊酸或茉莉酸甲酯對(duì)貯藏期間甜櫻桃果實(shí)抗病性誘導(dǎo)的影響，采后生物學(xué)和技術(shù)，2005，35:253-262)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于拮抗酵母和天然的植物抗性激發(fā)子結(jié)合施用的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，依次包括以下步驟I)、調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度為gSlOSiimol/L，于室溫下將柑橘果實(shí)放入密閉容器內(nèi)熏蒸處理2226小時(shí)；2)、將步驟I)所得的柑橘果實(shí)從密閉容器內(nèi)取出，然后自然通風(fēng)；3)、將步驟2)所得的通風(fēng)處理后的柑橘果實(shí)放入濃度為IXIO10^lXIO12細(xì)胞/升的羅倫隱球酵母懸浮液中浸泡I3分鐘；取出后自然通風(fēng)吹干。作為本發(fā)明的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法的改進(jìn)所述步驟I)將柑橘果實(shí)放入密閉容器內(nèi)時(shí)，需保證密閉容器內(nèi)的空氣體積為密閉容器容量的50%75%。作為本發(fā)明的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法的進(jìn)一步改進(jìn)羅倫隱球酵母的保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10,保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年I月20日，保藏號(hào)CGMCCNO.3590。作為本發(fā)明的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟I)中調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度為lOOymol/L(熏蒸處理24小時(shí)為最佳);所述步驟3)中羅倫隱球酵母懸浮液的濃度為IXIO11細(xì)胞/升。采用本發(fā)明方法處理后的柑橘果實(shí)可按照常規(guī)方式在常溫或低溫下貯藏。在本發(fā)明的步驟I)中，可將茉莉酸甲酯(MeJA)試劑滴于濾紙或干燥的脫脂棉上，從而使密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度達(dá)到所需濃度。步驟I)將柑橘果實(shí)放入密閉容器內(nèi)時(shí)，需保證密閉容器內(nèi)的空氣體積為密閉容器容量的50%75%(較佳為70%)，即，柑橘果實(shí)的體積一般占密閉容器容量的2550%，這樣能保證密閉容器的含氧量約占密閉容器容量的10.5%-15.75%。步驟2)的自然通風(fēng)時(shí)間一般為廣2小時(shí)。步驟3)的自然通風(fēng)吹干時(shí)間為廣2小時(shí)。本發(fā)明所用的羅倫隱球酵母懸浮液是指經(jīng)過(guò)菌種活化后制備而成?；罨蟮木w在3000rpm條件下離心分離IOmin,用無(wú)菌蒸懼水洗2次,去除培養(yǎng)基質(zhì)；用無(wú)菌蒸懼水懸浮羅倫隱球酵母細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板的方法確定酵母的濃度，并用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整到所需的濃度。本發(fā)明的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法只有在保證茉莉酸甲酯熏蒸濃度、柑橘果實(shí)呼吸所需氧含量和確保酵母活性的基礎(chǔ)上才能發(fā)揮最佳防腐效應(yīng)，通過(guò)復(fù)合處理增效，能顯著提高對(duì)柑橘果實(shí)病害的控制效果。需要特別說(shuō)明的是雖然已有論文報(bào)道利用茉莉酸甲酯對(duì)枇杷果實(shí)在常溫下進(jìn)行熏蒸處理，其熏蒸處理濃度為10umol/L,對(duì)桃果實(shí)熏蒸處理濃度為IUmol/L,0.Iyl/L茉莉酸甲酯熏蒸處理鮮切小蒼蘭花花瓣。但是由于不同果實(shí)對(duì)茉莉酸甲酯的最佳響應(yīng)濃度是不同的，且果實(shí)的熏蒸處理效果并非濃度越高越好。因此在發(fā)明過(guò)程中，首先需要找到柑橘果實(shí)對(duì)應(yīng)的合適的處理濃度。本發(fā)明通過(guò)大量試驗(yàn)找到了對(duì)于柑橘果實(shí)合適的處理濃度為100umol/Lo現(xiàn)有技術(shù)均沒(méi)有考慮熏蒸處理時(shí)含氧量的要求，而發(fā)明人在發(fā)明過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由于果實(shí)采后仍進(jìn)行呼吸作用，若密閉容器中含氧量過(guò)低會(huì)加速果實(shí)衰老，引起病害，因此本發(fā)明在處理過(guò)程中注意了容器中的空氣含量，其空氣體積為容器的50%-75%，其含氧量約為容器體積的10.5%-15.75%。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)還在于利用在室溫下進(jìn)行茉莉酸甲酯熏蒸處理，能減少對(duì)果實(shí)處理?xiàng)l件控制的難度及對(duì)處理設(shè)備的要求，操作簡(jiǎn)單；同時(shí)結(jié)合羅倫隱球酵母，成功使兩種主要的抗菌防病原理不同的處理方式結(jié)合，顯著抑制了果實(shí)的腐爛率，且抑制效果顯著好于兩者的單一處理；本發(fā)明對(duì)采收成熟度及成熟度較高的果實(shí)均有較好的防腐效果。綜上所述，本發(fā)明提供的結(jié)合施用的生物防腐保鮮劑有效整合了茉莉酸甲酯對(duì)柑橘果實(shí)抗性的誘導(dǎo)效應(yīng)和生防酵母的抑菌活性，從而有效抑制了柑橘果實(shí)病害的發(fā)生和發(fā)展。本方法簡(jiǎn)易了茉莉酸甲酯試劑的施用方式，簡(jiǎn)化了結(jié)合施用的生物防腐保鮮劑的操作方法。本發(fā)明具有安全高效、環(huán)境友好、果實(shí)防治病害、防腐保鮮效果顯著的優(yōu)點(diǎn)。該方法的使用有利于逐步替代化學(xué)殺菌劑為主的果實(shí)真菌病害的防治方法。對(duì)保證食品安全、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)民增收、果實(shí)出口創(chuàng)匯等具有重要意義。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I是實(shí)驗(yàn)I中不同空氣含量(氧含量)及MeJA處理濃度對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病發(fā)病率的控制效果對(duì)比圖。具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施案例。選用本地早、櫳柑果實(shí)。茉莉酸甲酯購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。羅倫隱球酵母懸浮液的配制過(guò)程如下以下所用的NYDA培養(yǎng)基為牛肉浸膏Sg，酵母粉5g，葡萄糖10g，瓊脂20g，水定容1000ml，高壓(0.IMPa,121°C，30分鐘)滅菌。所用的NYDB液體培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g，酵母粉5g,葡萄糖IOg,水定容1000ml,高壓(0.IMPa,121。。,30分鐘)滅菌。羅倫隱球酵母CGMCCNO.3590在低溫(4°C)下保存在NYDA培養(yǎng)基中。培養(yǎng)程序依次為⑴、活化羅倫隱球酵母CGMCCNO.3590先在NYDA培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)48h，然后重復(fù)傳代培養(yǎng)2次(每次均為在NYDA培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)48h)；⑵、液體培養(yǎng)將上述重復(fù)傳代2次所得的活化好的酵母用接種環(huán)接到NYDB液體培養(yǎng)基中，于200rpm、28°C下培養(yǎng)24h，然后在相同條件下重復(fù)培養(yǎng)I次(即將NYDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的酵母用無(wú)菌移液器接種到NYDB液體培養(yǎng)基中于200rpm、28°C下培養(yǎng)24h)；(3)、離心分離將步驟⑵所得的培養(yǎng)所得物于3000rpm條件下離心分離IOmin,用無(wú)菌蒸餾水洗2次，去除培養(yǎng)基質(zhì)；⑷、酵母細(xì)胞懸浮和確定濃度用無(wú)菌蒸餾水懸浮羅倫隱球酵母細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板確定酵母細(xì)胞的濃度，并用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整到所需的濃度，使最終每L羅倫隱球酵母懸浮液中含有IXIO10^lXIO12個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞。實(shí)施例I、一種柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，柑橘果實(shí)為櫳柑柑橘果實(shí)，依次進(jìn)行以下步驟I)、調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯(MeJA)的濃度為100ymol/L，于室溫下將柑橘果實(shí)放入所述密閉容器內(nèi)熏蒸處理24小時(shí)；柑橘果實(shí)的體積占密閉容器容量的30%，即，密閉容器內(nèi)的空氣體積為密閉容器容量的70%，此時(shí)密閉容器內(nèi)的含氧量約為密閉容器容量的12.8%(體積比)；2)、將步驟I)所得的柑橘果實(shí)從密閉容器內(nèi)取出，然后自然通風(fēng)廣2小時(shí)；3)、將步驟2)所得的通風(fēng)處理后的柑橘果實(shí)放入濃度為IXIO8個(gè)細(xì)胞/毫升的羅倫隱球酵母懸浮液中浸泡I3分鐘；取出后自然通風(fēng)吹干(廣2小時(shí))。最后將柑橘果實(shí)放入薄膜保鮮袋裝箱貯藏。實(shí)施例2、一種柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，柑橘果實(shí)為櫳柑柑橘果實(shí)，依次進(jìn)行以下步驟I)、調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯(MeJA)的濃度為100ymol/L，于室溫下將柑橘果實(shí)放入所述密閉容器內(nèi)熏蒸處理24小時(shí)；柑橘果實(shí)的體積占密閉容器容量的70%，即，密閉容器內(nèi)的空氣體積為密閉容器容量的30%，此時(shí)密閉容器內(nèi)的含氧量約為密閉容器容量的5%(體積比)；步驟2)步驟3)同實(shí)施例I。實(shí)驗(yàn)I、保鮮效果評(píng)價(jià)分別設(shè)置以下處理進(jìn)行對(duì)比處理I(即空白對(duì)照)為未經(jīng)茉莉酸甲酯熏蒸處理和羅倫隱球酵母懸浮液中浸泡處理的櫳柑柑橘果實(shí)。處理2(實(shí)施例I):按照本發(fā)明的實(shí)施例I進(jìn)行處理的櫳柑柑橘果實(shí)。處理3(實(shí)施例2):按照本發(fā)明的實(shí)施例2進(jìn)行處理的櫳柑柑橘果實(shí)。處理4(對(duì)比組I):將實(shí)施例I的步驟I)中茉莉酸甲酯(MeJA)的濃度改為150i!mOl/L，其余均同實(shí)施例I;按此方式處理而得的櫳柑柑橘果實(shí)。處理5(對(duì)比組2):將實(shí)施例I的步驟I)中茉莉酸甲酯(MeJA)的濃度改為50iimoI/L，其余均同實(shí)施例I;按此方式處理而得的櫳柑柑橘果實(shí)。備注上述處理f處理5中的櫳柑柑橘果實(shí)均為無(wú)機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度基本一致，用自來(lái)水沖洗后室溫下放干至果實(shí)表面無(wú)水滴的櫳柑柑橘果實(shí)。用消過(guò)毒的打孔器在上述每個(gè)處理后柑橘果實(shí)皮層表面打出孔徑大小、深度同一的傷口(可加3050iiL液體)，果實(shí)傷口處加入同體積的無(wú)菌水，孔風(fēng)干后加入20iiL、濃度為IXIO4個(gè)孢子/毫升的指狀青霉(Penicilliumdigitatum)孢子懸浮液。柑橘果實(shí)處理完畢后用PE塑料膜密封保濕處理，于常溫(25°C)貯藏。每天定時(shí)對(duì)果實(shí)發(fā)病情況進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均病害發(fā)生率(％)表示。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)12個(gè)果實(shí)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次以上。以下結(jié)果為處理后第3飛天檢測(cè)所得，對(duì)櫳柑柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果如表I所示，具體比較分析見(jiàn)圖I。表I對(duì)櫳柑柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果對(duì)比處理發(fā)病率(％)第三天第四天第五天處理I(空白對(duì)照)94.丨9±5.04丨00±0丨00±0處理2(實(shí)施例I)50±8.3372.22±4.8177.78±12.73處理3(實(shí)施例2)55.55±4.8丨9丨.67±8.3494.44±9.62處理4(對(duì)比組I)36.54±10.7186.97±8.8492.31±7.69處理5(對(duì)比組2)49.丨3±5.8889.68土9.0297.62±4.12實(shí)驗(yàn)2、將實(shí)驗(yàn)I中的處理f處理5中的櫳柑柑橘果實(shí)改成本地早柑橘果實(shí)，其余同實(shí)驗(yàn)I。備注上述處理f處理5中的本地早柑橘果實(shí)均為無(wú)機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度基本一致，用自來(lái)水沖洗后室溫下放干至果實(shí)表面無(wú)水滴的本地早柑橘果實(shí)。以下結(jié)果為處理后第34天檢測(cè)所得，對(duì)本地早柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果如表2所示。表2、對(duì)本地早柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果權(quán)利要求1.柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，其特征是依次包括以下步驟1)、調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度為gSlOSiimol/L，于室溫下將柑橘果實(shí)放入所述密閉容器內(nèi)熏蒸處理2226小時(shí)；2)、將步驟I)所得的柑橘果實(shí)從密閉容器內(nèi)取出，然后自然通風(fēng)；3)、將步驟2)所得的通風(fēng)處理后的柑橘果實(shí)放入濃度為IXIO10^lXIO12細(xì)胞/升的羅倫隱球酵母懸浮液中浸泡I3分鐘；取出后自然通風(fēng)吹干。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，其特征是所述步驟I)將柑橘果實(shí)放入密閉容器內(nèi)時(shí)，需保證密閉容器內(nèi)的空氣體積為密閉容器容量的50%75%。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，其特征是所述羅倫隱球酵母的保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)ZJU10,保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年I月20日，保藏號(hào)=CGMCCNO.3590。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，其特征是所述步驟I)中調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度為lOOymol/L;所述步驟3)中羅倫隱球酵母懸浮液的濃度為IXlO11細(xì)胞/升。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種柑橘果實(shí)生物防腐保鮮方法，依次包括以下步驟1)、調(diào)節(jié)密閉容器內(nèi)茉莉酸甲酯的濃度為95~105μmol/L，于室溫下將柑橘果實(shí)放入密閉容器內(nèi)熏蒸處理22~26小時(shí)；2)、將步驟1)所得的柑橘果實(shí)從密閉容器內(nèi)取出，然后自然通風(fēng)；3)、將步驟2)所得的通風(fēng)處理后的柑橘果實(shí)放入濃度為1×1010~1×1012細(xì)胞/升的羅倫隱球酵母懸浮液中浸泡1～3分鐘；取出后自然通風(fēng)吹干。文檔編號(hào)A23B7/155GK102652517SQ20121015087公開(kāi)日2012年9月5日申請(qǐng)日期2012年5月14日優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日發(fā)明者余挺,朱瑞瑜,鄭曉冬,郭峻,錢成濟(jì)申請(qǐng)人:浙江大學(xué)