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一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):609281閱讀:285來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域,尤其涉及一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
大蔥(Alliumfistulosum L. var. giganteum Makino),植物學(xué)分類屬于百合科(Liliaceae)、蔥屬(Allium)、蔥種(f istulosum)中的一個(gè)變種(var. giganteum Makino)。以葉鞘抱合而成的肥大假莖(蔥白)為主要產(chǎn)品,因在蔥中植株高大而得名。大蔥在蔥蒜類蔬菜中占有非常重要的位置,是中國(guó)人日常生活中不可缺少的重要蔬菜作物之一。在中國(guó)普遍栽培,全國(guó)常年栽培大蔥約計(jì)50多萬(wàn)hm2,年產(chǎn)大蔥1760多萬(wàn) t。大蔥主要分布在中國(guó)的秦嶺-淮河以北地區(qū)。其中,山東、河南、河北、遼寧等省份栽培較為集中,單產(chǎn)水平也較高。大蔥營(yíng)養(yǎng)成分豐富,據(jù)測(cè)定每百克大蔥含蛋白質(zhì)I 2. 4g,脂肪O. 3g,碳水化合物
6 8. 6g,熱量32千卡,粗纖維O. 5g, I丐12mg,磷46mg,鐵O. 6mg,胡蘿卜素I. 2mg,硫胺素O. 08mg,核黃素O. 05mg,尼克酸O. 5mg,抗壞血酸14mg,所含胡蘿卜素高于瓜菜類和豆菜類蔬菜。另外,大蔥還含有揮發(fā)性的硫化丙烯等芳香物質(zhì),既可作為蔬菜和調(diào)味品,也具有良好的藥用效果。大蔥的管狀葉和假莖(蔥白)均可食用,生食或熟食皆宜。大蔥是非常重要的香辛類蔬菜,其味辛,性溫,食用可開胃消食、殺菌防病等。據(jù)明代李時(shí)珍《本草綱目》記載,蔥之莖白、根須、葉、汁、花均可入藥,對(duì)大蔥不同部位的性質(zhì)和治病作用已進(jìn)行了詳細(xì)闡述,記有54個(gè)藥方,可治10余種疾病。主治傷寒寒熱,除肝邪氣,治霍亂轉(zhuǎn)筋,利大小便,解耳鳴?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為大蔥具有刺激血液循環(huán)等功效。對(duì)痢疾桿菌、葡萄球菌等有殺滅作用。因?yàn)榇笫[生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),開花期較短,單果結(jié)籽數(shù)較少,自交衰退較明顯等特點(diǎn),所以開展大蔥育種難度較大,從而限制了大蔥育種研究工作的開展,國(guó)內(nèi)外從事大蔥育種研究的人員較少,因此,大蔥育種研究相對(duì)滯后。長(zhǎng)期以來(lái),我國(guó)大蔥育種一直以選種為主,各地栽培的大蔥名產(chǎn)品種和推廣的新品種,主要是采用選種方法育成。自上世紀(jì)70年代日本和我國(guó)才陸續(xù)開展了大蔥雄性不育系及其利用研究,開始了大蔥一代雜種選育,但是,一代雜種選育進(jìn)展緩慢,至今在生產(chǎn)上沒(méi)有得到較大面積推廣。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所、章丘市農(nóng)業(yè)局、遼寧省農(nóng)科院園藝系等單位,利用自然群體中的不育株,通過(guò)4-5代回交,先后育成大蔥雄性不育系和相應(yīng)保持系。陳立東、王景峰等育成了超早熟大蔥雄性不育系603A、626A ;張啟沛、魏佑營(yíng)等育成了大蔥不育系4A、5A、225A、237A ;佟成富、唐成英等育成了大蔥不育系244A[佟成富,唐成英,崔連偉.大蔥雄性不育系244A及其雜交種遼蔥二號(hào)(9746F1)的選育及利用.全國(guó)蔬菜遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集,2002. 301-307];陳運(yùn)起、高莉敏等育成了大蔥雄性不育系9801A、9802A 等。
為加快大蔥雄性不育系選育進(jìn)程,蓋樹鵬、孟祥棟等(2004)利用RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記初步建立了大蔥不育系、保持系分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)體系[蓋樹鵬,孟祥棟等.大蔥雄性不育分子標(biāo)記輔助選擇的研究.分子植物育種,2004,2 (2) :223-228]??梢詼p少工作量,縮短部分大蔥品種的育種年限,但是不能在廣泛的育種材料中實(shí)現(xiàn)苗期選擇。加強(qiáng)生物技術(shù)與常規(guī)育種的結(jié)合生物技術(shù)的發(fā)展給園藝植物遺傳育種帶來(lái)了巨大的變化,分子標(biāo)記技術(shù)已成為育種研究的重要組成部分。但是,要使分子標(biāo)記成為育種的一種常規(guī)手段,尚有許多問(wèn)題有待解決。如重要性狀基因的精細(xì)定位,檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化,飽和遺傳圖譜的構(gòu)建等。生物技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合,將有力的推動(dòng)大蔥遺傳育種學(xué)的發(fā)展。加快雄性不育系與一代雜種選育優(yōu)良雄性不育系選育是選育一代雜種、利用雜種優(yōu)勢(shì)的重要前提,從大蔥制種田發(fā)現(xiàn)不育株后,通過(guò)回交或體細(xì)胞雜交、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞質(zhì)基因工程等技術(shù)轉(zhuǎn)育成更多的優(yōu)良雄性不育系,進(jìn)而培育出優(yōu)勢(shì)明顯的一代雜種。隨著 大蔥育種研究的不斷深入,大蔥一代雜種選育與利用將進(jìn)一步加快,大蔥一代雜種的推廣覆蓋率將迅速提高。日本的馬上武彥等(1985),用大蔥雄性不育材料連續(xù)三次回交與7個(gè)品種雜交,觀察植株花粉和種子的育性,判定大蔥雄性不育的遺傳模式,研究結(jié)果認(rèn)為大蔥雄性不育是受胞質(zhì)與核基因互作控制,雄性不育與保持系分別由兩對(duì)基因S(mSlmSlmS2mS2)和N(mslmslms2ms2)支配,雄性不育性可用于大蔥雜交育種。近年來(lái),分子生物學(xué)的發(fā)展為植物遺傳標(biāo)記提供了一種基于DNA變異的新技術(shù)手段,即分子標(biāo)記技術(shù)。DNA分子標(biāo)記研究與應(yīng)用的迅速發(fā)展為植物遺傳育種注入新的活力,并使傳統(tǒng)育種技術(shù)發(fā)生了深刻的變化。DNA分子標(biāo)記的研究始于1980年,現(xiàn)已有數(shù)十種標(biāo)記技術(shù)。與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比,DNA分子標(biāo)記有很多優(yōu)點(diǎn)。以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋技術(shù)大大加快了 DNA分子標(biāo)記的研究和利用,廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位和克隆、植物親緣關(guān)系鑒別及遺傳多樣性研究、分子標(biāo)記輔助選擇育種等領(lǐng)域。植物育種中分子標(biāo)記輔助選擇是通過(guò)分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)判斷目標(biāo)基因是否存在的。通過(guò)不同分子標(biāo)記技術(shù)的分析可篩選出與目標(biāo)基因性狀緊密連鎖的DNA片段,這樣可以作為輔助育種的分子標(biāo)記。應(yīng)用這些分子標(biāo)記進(jìn)行間接選擇,將得到事半功倍的作用,因?yàn)榉肿訕?biāo)記輔助選擇不受植物生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)期及環(huán)境的影響,不存在表達(dá)與否的問(wèn)題。無(wú)論是與細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)還是與核基因連鎖的標(biāo)記的輔助選擇都可減少工作量,提高育種效率。利用與細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記可鑒別出單株的細(xì)胞質(zhì)類型,淘汰可育材料中S型細(xì)胞質(zhì),只能從N型細(xì)胞質(zhì)類型的單株中選擇保持系,從而減少測(cè)交組合數(shù)和自交株數(shù),減少工作量,避免盲目性,提高選擇效果。原有報(bào)道的通過(guò)提取大蔥線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到2800bp片段的分子標(biāo)記不能在廣泛的大蔥材料中應(yīng)用,應(yīng)用范圍較窄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,擬采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及一種用于大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒,其特征在于包括如下的SCAR (Sequence-characterized Amplified Region序列特異性擴(kuò)增區(qū))標(biāo)記引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3';反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑。在本發(fā)明的另一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方式中,所述的試劑盒包括PCR擴(kuò)增所需要的試劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述的試劑盒包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。本發(fā)明另一方面還涉及上述試劑盒在大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述應(yīng)用包括用CTAB法提取大蔥總DNA,然后使用所述的SCAR標(biāo)記引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷所檢測(cè)的植株是否是細(xì)胞質(zhì)不育類型。本發(fā)明的試劑盒可以廣泛應(yīng)用于我國(guó)遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細(xì)胞質(zhì)的育性鑒定。本發(fā)明通過(guò)提取大蔥總DNA即可,避免了提取線粒體DNA的復(fù)雜操作,使操作過(guò)程更簡(jiǎn)單有效。分子標(biāo)記輔助選擇操作簡(jiǎn)單,節(jié)約成本和時(shí)間,為大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種體系奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I合成大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育SCAR標(biāo)記的引物正向引物WMS607L:5' CATAAGACTTGCCCTGAG3';反向引物WMS607R:5' TTCGCTATGTTCTATGTGAG3'。選擇已知基因型的個(gè)體材料共220份,對(duì)大蔥DNA提取采用北京天根生產(chǎn)的植物基因組CTAB法提取試劑盒(也可以使用其它常規(guī)的CTAB法提取試劑盒進(jìn)行提取)以及試劑盒中所述方法進(jìn)行提??;PCR擴(kuò)增在美國(guó)伯樂(lè)TC-XP-D型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行,20 μ L體系,其中 2x Taq MasterMixlO μ L, Primerl、2 (10umol/L)各 I. O μ L,樣品 DNAl μ L,反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min,94°C變性30sec,53°C退火lmin,72°C延伸lmin,35個(gè)循環(huán),72°C延伸5min,4°C保存;PCR產(chǎn)物在I. 2 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離分析,溴化乙啶染色,凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)成像;特異條帶回收純化,按照Gel Extract ion Kit使用說(shuō)明;連接、轉(zhuǎn)化、鑒定按照PGM-T克隆試劑盒說(shuō)明;DNA序列測(cè)定委托北京博尚生物技術(shù)有限公司完成。對(duì)已知育性的220份材料進(jìn)行PCR驗(yàn)證(見表I),按照本發(fā)明實(shí)施例中的方法,所有的不育系中均擴(kuò)增出大小為607bp的片段,而保持系中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR結(jié)果與田間判斷相吻合。說(shuō)明應(yīng)用這對(duì)引物完全可以鑒別大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型,據(jù)此得知擴(kuò)增出的607bp片段與雄性不育有一定的聯(lián)系。對(duì)以上大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系980238A、200501A中擴(kuò)增出的特異片段經(jīng)過(guò)回收、轉(zhuǎn)化、克隆和測(cè)序,得到的結(jié)果一致,序列全長(zhǎng)607bp,核苷酸序列如SEQ ID No. I所示,兩端含有引物序列,其堿基組成為A+T = 55%,C+G = 45%。表I大蔥不育系和保持系單株驗(yàn)證結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒,其特征在于包括如下的SCAR標(biāo)記引物 正向引物WMS607L :5' -CATAAGACTTGCCCTGAG-3'; 反向引物WMS607R :5' -TTCGCTATGTTCTATGTGAG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,所述的試劑盒包括CTAB法提取DNA所需要的試劑,所述的試劑優(yōu)選的是北京天根生產(chǎn)的的植物基因組提取試劑盒中的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,所述的試劑盒包括PCR擴(kuò)增所需要的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,所述的試劑盒包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳的試劑盒以及DNA Maker。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒在大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,所述應(yīng)用包括用CTAB法提取大蔥總DNA,然后使用所述的SCAR標(biāo)記引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳以確定有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物以及擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷所使用的大蔥是否屬于細(xì)胞質(zhì)不育系O
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的檢測(cè)試劑盒及其大蔥輔助選擇育種中的應(yīng)用,所述的試劑盒包括SCAR標(biāo)記引物正向引物WMS607L5′CATAAGACTTGCCCTGAG 3′;反向引物WMS607R5′TTCGCTATGTTCTATGTGAG 3′。本發(fā)明的試劑盒可以廣泛應(yīng)用于我國(guó)遼寧大蔥、河南大蔥、山東大蔥以及日本大蔥等細(xì)胞質(zhì)的育性鑒定。本發(fā)明通過(guò)提取大蔥總DNA即可,避免了提取線粒體DNA的復(fù)雜操作,使操作過(guò)程更簡(jiǎn)單有效。分子標(biāo)記輔助選擇操作簡(jiǎn)單,節(jié)約成本和時(shí)間,為大蔥分子標(biāo)記輔助選擇育種體系奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851379SQ20121034897
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者高莉敏, 陳運(yùn)起, 董飛, 孔素萍 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所
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