嵌合抗菌多肽的制作方法
【專利摘要】本文中提供了抗菌組合物以及制備和使用該組合物的方法。
【專利說明】嵌合抗菌多肽【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了減少微生物菌落生長(包括感染)的方法和組合物，且包括治療感染的治療性組合物、方法，以及鑒別其他此類組合物的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]細(xì)菌無處不在、生態(tài)學(xué)上多種多樣，且可在特殊的生存生境中生存。它們存在于所有環(huán)境中，例如，土壤、灰塵、水和幾乎所有表面上。
[0004]致病菌可以引起人、其他動物和植物的傳染性疾病。一些細(xì)菌僅能感染特定宿主或給其造成問題，而其他細(xì)菌則具有更為廣泛的宿主特異性，且能給許多宿主造成問題。由細(xì)菌引起的疾病幾乎與細(xì)菌自身一樣多種多樣，例如，食物中毒、齲齒、炭疽熱、常規(guī)傳染性疾病，以及甚至某些形式的癌癥。
[0005]某些細(xì)菌通常是無害的，但在合適的時機變得具有致病性，在引入到異常位點或異常情形下變得可引起麻煩。缺少有效免疫系統(tǒng)的人最易受到攻擊，且某些細(xì)菌利用虛弱的宿主來進(jìn)行增殖并在該人群中傳播。
[0006]抗生素在過去的半個世紀(jì)中革新了臨床醫(yī)學(xué)。由于抗菌現(xiàn)象的首次發(fā)現(xiàn)，其作用機制和這類突出的治療性實體(entities)的發(fā)展取得了巨大的進(jìn)步。參見，例如，Therrien and Levesque (2000) FEMS Microbiol Rev.24:251-62:Durgess (1999)Che s 1115(3Supp1): 19S-23S ；Medeiros(1997)Cl in.1nfect.Pis.24(Suppll):S19_45: Tones (1996) Am.T.Med.100 (6A):3S_12S ；Ford and Hait(1993)Cvtotechnologvl2(l-3): 171-212 和 Liu (1992) Compr Ther.18:35-42。2002 年抗生素在全世界范圍內(nèi)具有約320億美元的銷量。
[0007]然而，耐抗生素菌的廣泛出現(xiàn)突出了當(dāng)前的抗菌治療相對于細(xì)菌適應(yīng)性的脆弱性。參見，例如，Walsh(1992)Antibiotics:Actions, Origins, Resistance Amer.Soc.Microbiol.;Cunha(1992)Antibiotic Essentials(Physicians Press);Amyes(2003)Magic Bullets,Lost Horizons: The Rise and Fall of Antibiotics (Taylor&Francis) ;Axelsen(2001)Essentials of Antimicrobial Pharmacology:A Guide toFundamentals for Practice(Humana Press)；以及 Mainous 和 Pomeroy(eds.2001)Management of Antimicrobials in Infectious Diseases:1mpact of AntibioticResistance (Humana Press)。已經(jīng)報道了一種多重耐藥質(zhì)粒 NDM-1 (Kumarasamy etal.(2010)Lancet Infectious DiseaseslO:597-602:以及 Walsh et al.(2011)Lancet Infectious Diseases, Early Online Publication, 7April2011, do1: 10.1016/S1473-3099(11) 70059-7)。
[0008]因此，改進(jìn)的減少細(xì)菌生長和存活或限制細(xì)菌致病性的方法具有巨大的效用，尤其是對于抗生素耐受菌，其多數(shù)通常為革蘭氏陰性的。抑菌效應(yīng)適用于環(huán)境、區(qū)域、局部且尤其是體內(nèi)的定殖。本發(fā)明解決了這些和其他重要的問題。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明提供了抗菌性嵌合多肽，其包含可穿越革蘭氏陰性菌外膜的組分(component)(即，跨膜結(jié)構(gòu)域或MTD)和用于降解細(xì)菌細(xì)胞壁(即，胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(muralytic domain)或 MD)的組分。
[0011]本發(fā)明提供了嵌合多肽，其包含源自表A所列MD源中一種的MD和源自表B所列MTD源中一種的MTD。在一些實施方案中，相比未處理的對照培養(yǎng)物，嵌合多肽可減少革蘭氏陰性菌培養(yǎng)物的CFU。在一些實施方案中，1-l00nmol的嵌合多肽可在CFU下降試驗(CFUdrop assay)中溶解至少50%的107個革蘭氏陰性菌。在一些實施方案中，所述細(xì)菌選自:綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis)、志賀氏菌(Shigella)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)和泰國伯克氏菌(Burkholderiathailandensis)。
[0012]在一些實施方案中，MTD包含選自以下的序列:SEQ ID NO:4的16-39位氨基酸；SEQ ID NO: 15 的 242-264 位氨基酸；SEQ ID NO: 17 的 242-271 位氨基酸；SEQ ID NO: 19 的220-406 位氨基酸；SEQ ID NO:21 的 220-400 位氨基酸；SEQ ID NO:23 的 220-885 位氨基酸；和DAS譜為1.2-2.6的以上序列的變體。在一些實施方案中，所述以上序列的變體有1-6個疏水性氨基酸被親水性分?jǐn)?shù)為_2或更低的氨基酸替換。在一些實施方案中，MTD的DAS譜低于2.5。在一些實施方案中，嵌合多肽的DAS譜低于2.5。在一些實施方案中，MTD包含選自以下的序列:SEQ ID NO: 4的16-39位氨基酸；SEQ ID NO: 15的242-264位氨基酸；SEQ ID NO: 17 的 242-271 位氨基酸；SEQ ID NO: 19 的 220-406 位氨基酸；SEQ ID N0:21 的220-400位氨基酸；SEQ ID N0:23的220-885位氨基酸；和以上序列的變體，所述變體與選自以下的序列具有至少80%(例如，至少85%、87%、90%、92%、95%、98%或99%)的相同性:SEQID NO: 4 的 16-39 位氨基酸；SEQ ID NO: 15 的 242-264 位氨基酸；SEQ ID NO: 17 的 242-271位氨基酸；SEQ ID NO: 19的220-406位氨基酸；SEQ ID NO: 21的220-400位氨基酸；SEQ IDNO:23的220-885位氨基酸。
[0013]在一些實施方案中，嵌合多肽包含選自以下的序列:SEQ ID N0s:9、ll、13、15、17、
19、21和23以及以上序列的變體，其中所述變體與SEQ ID N0s:9、ll、13、15、17、19、21或23具有至少90% (例如，至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的相同性。在一些實施方案中，以上序列的變體有1-10個半胱氨酸或甲硫氨酸氨基酸被非半胱氨酸、非甲硫氨
酸氨基酸替換。
[0014]在一些實施方案中，嵌合多肽包含MD，其包含SEQ ID NO: 2的737-875位氨基酸序列或該氨基酸序列的變體，且其能溶解經(jīng)氯仿處理過的革蘭氏陰性菌。在一些實施方案中，該氨基酸序列的變體與SEQ ID NO:2的737-875位氨基酸具有至少90%(例如，至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的相同性。在一些實施方案中，MD包含SEQ ID N0:2的683-889位氨基酸序列或該氨基酸序列的變體，其中所述變體與SEQ ID NO: 2的683-889位氨基酸具有至少90%(例如，至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的相同性。在一些實施方案中，l-100nmol的MD在CFU下降試驗中可溶解至少50%的107個經(jīng)氯仿處理過的綠膿桿菌細(xì)菌。在一些實施方案中，該氨基酸序列的變體有1-7個甲硫氨酸氨基酸被非甲硫氨酸氨基酸替換。
[0015]在一些實施方案中，嵌合多肽包含MD，其包含與SEQ ID NO: 2的737-875位氨基酸具有至少90%的相同性的序列，且MTD包含與SEQ ID NO:4的16-39位氨基酸具有至少80%的相同性的序列。在一些實施方案中，嵌合多肽包含與SEQ ID NO: 11或13具有至少95%(例如，96%、97%、98%、99%或100%)的相同性的序列。
[0016]在一些實施方案中，通過包含3-5個帶正電荷的氨基酸的連接臂(linker)(例如，R、H、K及其組合)連接MTD和MD。在一些實施方案中，帶正電荷的氨基酸是連續(xù)的或彼此很靠近(例如，具有1-3個插入中間的非正電荷氨基酸)。在一些實施方案中,MD位于N末端和C末端一側(cè)，并具有3-5個帶正電荷的氨基酸。在一些實施方案中，嵌合多肽被連接到PAG或PEG分子上。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提供了抗菌組合物，其包含如上所述的嵌合多肽。在一些實施方案中，抗菌組合物包含所述嵌合多肽——一種可減少氧化作用的藥劑。在一些實施方案中，抗菌組合物為包含所述嵌合多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療個體內(nèi)細(xì)菌感染的方法，例如，抑制細(xì)菌細(xì)胞生長和/或減少個體內(nèi)祀細(xì)菌的數(shù)目。在一些實施方案中，該方法包括將有效量包含嵌合多肽的藥物組合物給予到個體，例如，相比未處理的對照，從而抑制個體內(nèi)靶細(xì)菌的細(xì)胞生長。在一些實施方案中，該方法包括將有效量包含嵌合多肽的藥物組合物給予到個體，相比治療前存在的靶細(xì)菌的數(shù)目，從而減少個體內(nèi)靶細(xì)菌的數(shù)目。在一些實施方案中，靶細(xì)菌(可感染個體的細(xì)菌)選自:綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、志賀氏菌、奇異變形桿菌和泰國伯克氏菌。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步提供了減少靶細(xì)菌數(shù)目或抑制環(huán)境中細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，包括將如本文中描述的嵌合物應(yīng)用到環(huán)境中。在一些實施方案中，靶細(xì)菌選自:綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、志賀氏菌、奇異變形桿菌和泰國伯克氏菌。在一些實施方案中，所述環(huán)境為表面(例如，用于食物準(zhǔn)備或醫(yī)學(xué)應(yīng)用的)、藥物組合物、醫(yī)療設(shè)備、水源或液體源或食物產(chǎn)品。
[0020]本發(fā)明部分基于該認(rèn)識——作為噬菌體細(xì)胞溶解功能核心的噬菌體編碼的細(xì)胞壁降解活性，例如，胞壁質(zhì)-降解(或胞壁質(zhì)水解)酶，也被發(fā)現(xiàn)為噬菌體病毒粒子的結(jié)構(gòu)組分，它們可能為感染細(xì)菌所必須。革蘭氏陰性細(xì)菌的特征在于由外膜環(huán)繞薄的肽聚糖細(xì)胞壁，在革蘭氏陽性菌中缺乏該肽聚糖細(xì)胞壁。雖然胞壁質(zhì)水解酶可以降解革蘭氏陰性細(xì)胞的薄的肽聚糖層，但外膜通常可阻止胞壁質(zhì)水解活性從外面介質(zhì)中進(jìn)入。將酶促活性胞壁質(zhì)水解片段(segment/fragment)連接到藥劑(實體)上，提供了將片段轉(zhuǎn)移穿越外膜，從而允許酶活性接觸肽聚糖層，導(dǎo)致肽聚糖層的降解。由于穿越細(xì)胞膜內(nèi)膜的巨大滲透壓，肽聚糖層的毀壞導(dǎo)致細(xì)胞破裂。
[0021]本發(fā)明提供了重組性嵌合多肽，包含:
[0022]a)片段，其包含與BPI TMD的16_39位氨基酸相匹配的至少20個氨基酸；和
[0023]b)多個至少20個氨基酸的不同片段，其與GP36的683-898位氨基酸展現(xiàn)至少85%的相同性且其片段不重疊。
[0024]在一些實施方案中，至少20個氨基酸的片段匹配數(shù)為至少22處、23處或24處匹配。在一些實施方案中，所述多個數(shù)目至少為3。在一些實施方案中，所述不同的片段包括一個展現(xiàn)至少92%的 相同性的至少40個氨基酸的片段。在一些實施方案中，嵌合多肽相比GP36，展現(xiàn)出對源自革蘭氏陰性細(xì)菌宿主的純化肽聚糖的至少25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、75%、80%、85%、90%、95%或更高％的胞壁質(zhì)水解活性。在一些實施方案中，嵌合多肽相比SEQ ID NO:9的多肽，展現(xiàn)出對完整革蘭氏陰性細(xì)菌宿主的至少25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、75%、80%、85%、90%、95%或更高％的胞壁質(zhì)水解活性。在一些實施方案中，多肽與SEQ ID NO:9 的多肽展現(xiàn)出至少 85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列相同性。在一些實施方案中，嵌合多肽包含至少BPI TMD的16-39位氨基酸。在一些實施方案中，嵌合多肽包含與GP36的683-889位或737-875位氨基酸具有至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的序列。在一些實施方案中，所述嵌合多肽包含或由SEQID NO:9 組成。
[0025]在一些實施方案中，嵌合多肽大體上不含有其他噬菌體蛋白；或大體上不含有其他蛋白質(zhì)材料。在一些實施方案中，將所述嵌合多肽與另一抗菌劑組合，包括抗菌劑或解聚酶制劑。在一些實施方案中，將所述嵌合多肽與藥學(xué)賦形劑摻合在一起或?qū)⑵淙茉诰彌_性或無菌的組合物中。
[0026]在一些實施方案中，所述嵌合多肽展現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞壁降解活性，所述活性選自:胞壁質(zhì)水解活性、葡萄糖酰胺酶活性、胞壁酰胺酶活性、酰胺酶活性或肽鏈內(nèi)切酶活性。在一些實施方案中，細(xì)胞壁降解(例如，胞壁質(zhì)水解)活性對多種革蘭氏陰性的細(xì)菌菌株有效。在一些實施方案中，細(xì)胞壁降解(例如，胞壁質(zhì)水解)活性對假單胞菌(Pseudomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)或埃希氏菌(Escherichia)細(xì)菌菌株有效。在一些實施方案中，細(xì)胞壁降解(例如，胞壁質(zhì)水解)活性對下述一種或多種菌株有效:克雷伯氏菌(Klebsiella)、不動桿菌(Acinetobacter)、沙門氏菌(Salmonella),變形桿菌(Proteus),奈瑟氏菌(Neisseria),莫拉菌(Moraxella),嗜血桿菌(Hemophilus),腸桿菌(Enterobacter),沙雷氏菌(Serratia),軍團(tuán)菌(Legionella)或螺桿菌(Helicobacter)物種。
[0027]本發(fā)明提供了包含編碼本文中描述的嵌合多肽的單獨或重組核酸的表達(dá)載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞為真核或原核細(xì)胞，例如，用來表達(dá)核酸以制備或分泌蛋白。
[0028]本發(fā)明提供了例如，通過將細(xì)菌暴露于本文中描述的嵌合多肽來酶促降解細(xì)菌細(xì)胞壁的方法。在一些實施方案中，所述方法導(dǎo)致表面(例如，醫(yī)院、工作或家具等)上的敏感性細(xì)菌群體減少至少50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施方案中，所述方法包括引入嵌合多肽到動物(例如，人 或其他哺乳動物)體內(nèi)，并導(dǎo)致動物體內(nèi)或表面上選定位置的敏感性細(xì)菌群體減少至少20%。在一些實施方案中，將所述嵌合多肽與(施加到)動物表面或間室(compartment)(例如，消化道)接觸。在一些實施方案中，將嵌合多肽施加到(給予)個體來治療皮膚、粘膜組織、血液、尿路、呼吸道或胃腸道的細(xì)菌感染。在一些實施方案中，所述方法包括使用所述嵌合多肽以便用死的或溶解的細(xì)菌接種個體(誘導(dǎo)其體內(nèi)的免疫應(yīng)答)(參見，例如，W02003/026690)。
[0029]本發(fā)明還提供了嵌合多肽，包含:胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域，其包含來自SEQ ID NO:2的683-898位氨基酸的至少15個連續(xù)氨基酸的至少兩個非重疊性片段，和包含SEQ ID NO:4的16-39位氨基酸的外膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，其中所述胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域具有對靶細(xì)菌的細(xì)胞壁降解活性。在一些實施方案中，所述胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域包含來自與溶解性噬菌體的胞壁質(zhì)水解活性相關(guān)的病毒粒子的至少15個連續(xù)氨基酸的多個非重疊性片段。在一些實施方案中，所述胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域包含由前噬菌體結(jié)構(gòu)基因編碼的至少15個連續(xù)氨基酸的多個非重疊性片段。在一些實施方案中，所述胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域來自肌尾噬菌體或短尾噬菌體。在一些實施方案中，所述胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域源自噬菌體用來感染宿主細(xì)胞的胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域。
[0030]在一些實施方案中，靶細(xì)菌為革蘭氏陰性菌(具有細(xì)菌外膜)。在一些實施方案中，靶細(xì)菌為假單胞菌、埃希氏菌、伯克氏菌、克雷伯氏菌、不動桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、奈瑟氏菌、莫拉菌、嗜血桿菌、腸桿菌、沙雷氏菌、軍團(tuán)菌或螺桿菌物種。在一些實施方案中，靶細(xì)菌耐一種或多種臨床常用的抗菌劑(例如，抗菌劑耐受性)。
[0031]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療需要治療的對象(例如患有細(xì)菌感染或存在發(fā)展為感染的風(fēng)險的個體)體內(nèi)的細(xì)菌感染的方法，包括:將如本文中描述的嵌合多肽給予到對象，從而治療細(xì)菌感染(例如，減少個體內(nèi)靶細(xì)菌的數(shù)目)。對象可以為患者或患獸，包括人、靈長類動物、表演用動物或?qū)櫸铩Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，所述方法?dǎo)致在個體內(nèi)靶革蘭氏陰性細(xì)菌群體的CFU減少至少20%、25%、30%、50%、60%、70%、80%或更高％，或在培養(yǎng)物中減少至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更高％(或在體外應(yīng)用中，例如，在表面上)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過用嵌合多肽(或其組合物)接觸液體表面對表面或液體消毒的方法。
[0032]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備嵌合多肽的方法，包括表達(dá)可編碼嵌合多肽的核酸，例如，在真核細(xì)胞內(nèi)。在一些實施方案中，核酸位于諸如質(zhì)粒的表達(dá)載體內(nèi)。
[0033]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含連接到胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域上的BPI TMD的16-39位氨基酸的重組胞壁質(zhì)水解蛋白，其中所述蛋白具有細(xì)菌外膜穿越能力(活性)和肽聚糖降解活性。在一些實施方案中，胞壁質(zhì)水解蛋白相比GP36，具有對源自革蘭氏陰性菌的純化肽聚糖的50%、55%、 60%、75%、80%、85%、90%、95%或更高％的肽聚糖降解活性。在一些實施方案中，使用非肽鍵將BPI TMD的16-39位氨基酸和胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域連接在一起。在一些實施方案中，胞壁質(zhì)水解蛋白為嵌合蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可編碼胞壁質(zhì)水解蛋白的重組核酸和包含所述核酸的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于殺傷擁有外膜的細(xì)菌的方法，包括將該菌與胞壁質(zhì)水解蛋白接觸。
[0034]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了重組胞壁質(zhì)水解蛋白，其包含連接到膜轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域上的GP36的737-875位氨基酸(或GP36的683-889位氨基酸)，其中所述蛋白具有細(xì)菌外膜穿越能力和肽聚糖降解活性。在一些實施方案中，所述胞壁質(zhì)水解蛋白相比BP1-TMD,具有50%、55%、60%、75%、80%、85%、90%、95%或更高％的細(xì)菌外膜穿越活性。在一些實施方案中，使用非肽鍵將BPI TMD的16-39位氨基酸和胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域連接在一起。在一些實施方案中，胞壁質(zhì)水解蛋白為嵌合蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼胞壁質(zhì)水解蛋白的重組核酸和包含核酸的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于殺傷擁有外膜的細(xì)菌的方法，包括將該菌與胞壁質(zhì)水解蛋白接觸。
[0035]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了單獨的重組胞壁質(zhì)水解蛋白，其包含連接到膜轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(提供細(xì)菌外膜穿越能力)上的胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(提供肽聚糖降解活性)。進(jìn)一步提供了可編碼胞壁質(zhì)水解蛋白的重組型核酸和包含核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過將該細(xì)菌與胞壁質(zhì)水解蛋白接觸用于殺傷擁有外膜的細(xì)菌的方法。
[0036]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了對胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域和膜轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的新的組合具有特異性的抗體，例如，可識別結(jié)合多肽的唯一表位的抗體。在一些實施方案中，抗體對SEQ ID N0:9的多肽和與SEQ ID NO:9具有至少85%、90%、92%、95%或更高％相同性的多肽具有特異性，但不明顯地結(jié)合到SEQ ID N0:4的多肽或SEQ ID N0:5的多肽上。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了方法來檢測或分離如本文中描述的嵌合多肽，包括將抗體與包含嵌合多肽的液體或表面接觸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1顯示了(A)P266和(B)P275的DAS疏水性圖。沿著蛋白質(zhì)的長度顯示了相對疏水性，其中N端在左，且C端在右。注意在修飾的P275蛋白中被減少的P266的C末端刺關(guān)。
[0038]圖2顯示了(A)P266和(B)P275的TMHMM(使用隱馬爾可夫模型的跨膜)預(yù)測。盡管該程序不預(yù)測P275的跨膜結(jié)構(gòu)域，所述嵌合蛋白仍然可在與P266相同的水平下有效穿越細(xì)菌外膜并殺傷細(xì)菌。
[0039]圖3顯示了使用(A)DAS圖、⑶TMHMM和(C)Kyte Doolittle預(yù)測的大腸桿菌跨膜蛋白CydA的疏水性測量和跨膜預(yù)測。DAS圖顯示第6個和第7個預(yù)測的TMDs具有相對高的疏水性，表明這些結(jié)構(gòu)域可以作為氨基酸替換的靶標(biāo)。
[0040]發(fā)明詳述
[0041]1.簡介
[0042]肽聚糖(胞壁質(zhì))小囊是大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞壁的必要結(jié)構(gòu)組件。由通過短肽交叉結(jié)合的聚糖鏈構(gòu)成，該小囊形成了環(huán)繞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的袋狀封閉結(jié)構(gòu)。小囊必須經(jīng)受多達(dá)25個大氣壓的滲透壓。小囊具有彈性，允許壓力下的可逆擴(kuò)張，其允許甚至大蛋白分子的擴(kuò)散。參見，例如，Silhavy et al.(2010)CSH Persp.Biol..2:a000414 ；Vollmer et al.(200 8)FEMS Microbi0.Revs32:149-167 ；Bos et al.(2007)Ann.Rev.Microbiol.61:191-214 以及 Costerton et al.(1974)Bact.Revs.38:87-110。
[0043]許多抗生素作用于靶細(xì)菌物種的肽聚糖層。因此該結(jié)構(gòu)為靶細(xì)菌生存的關(guān)鍵組件。攻擊肽聚糖是殺傷靶細(xì)菌宿主的合理策略。盡管肽聚糖層通常為約1-3層厚，外膜起著滲透屏障的作用，其可阻止外部施加的胞壁質(zhì)水解酶到達(dá)它們的基質(zhì)。
[0044]本發(fā)明將胞壁質(zhì)水解功能與膜通透性功能結(jié)合起來以獲得新的實體。本文描述的嵌合(和連接)構(gòu)建體(construct)將肽聚糖降解酶活性與膜穿越功能組合。在一些實施方案中，使蛋白具有胞壁質(zhì)水解活性的蛋白片段被轉(zhuǎn)移穿越細(xì)菌外膜而實現(xiàn)穿越功能。在一些實施方案中，穿越片段本身可調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)移事件，從而將胞壁質(zhì)水解活性從細(xì)菌外膜的外部移到內(nèi)部，從而允許酶和其肽聚糖基質(zhì)間的接觸。在一些實施方案中，穿越片段通過展現(xiàn)向系統(tǒng)發(fā)出信號以將分子輸入到細(xì)胞周質(zhì)間隙的特征基序(earmark)，利用了外膜中的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。在一些實施方案中，穿越片段引導(dǎo)胞壁質(zhì)水解多肽進(jìn)入到外膜的外部小葉中，然后胞壁質(zhì)水解多肽從外膜的外部小葉反轉(zhuǎn)到內(nèi)部小葉中，從而將胞壁質(zhì)水解片段遞送到肽聚糖基質(zhì)。
[0045]I1.胞壁質(zhì)降解酶、溶菌酶和細(xì)胞溶解素
[0046]胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(本文中也稱為催化結(jié)構(gòu)域)，包括例如溶菌酶蛋白(Salazar 和 Asenjo (2007) Biotechnol.Lett.29:985-94)。天然情況下妝聚糖結(jié)構(gòu)的破壞在至少4種情形下發(fā)生。一種為結(jié)構(gòu)本身的生物合成；當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞生長和分裂時，其必須要破壞該結(jié)構(gòu)。參見，例如，Vollmer (2008)FEMS Microbiol Rev.32:287-306 ；Scheurwater, et al.(2008) Int.T.Biochem.Cell Biol.40: 586-91 ；Keep, et al.(2006)Trends Microbiol.14:271-276,以及 Baba 和 Schneewind(1998)EMBO T.17:4639-4646。存在細(xì)胞自身必須重新排列或修飾之前合成的結(jié)構(gòu)的其他情形。這些活性可能來源于細(xì)菌自己。第二，真核宿主在清除感染時降解該結(jié)構(gòu)，例如，使用變?nèi)芫鼗蛉芫?。參見，例如，Callewaert 和 Michiels (2010) T.Biosc1.35:127-60 ；Harder, et al.(2007)Endocr.Metab.Tmmune Disord Drug Targets7:75~82, 以及 Lichtman, et al.(1992)T.Clin.1nvest.90:1313-1322。這些活性通常來源于細(xì)菌所生活或能夠定殖的真核宿主。第三個區(qū)域為在噬菌體復(fù)制中，其中噬菌體通常采用細(xì)胞內(nèi)溶素來釋放復(fù)制的噬菌體并溶解細(xì)菌宿主細(xì)胞。參見，例如，Srividhya 和 Krishnaswamy (2007) J.Biosc1.32:979-90,以及Loessner (2005) Curr.0pin.Microbiol.8:480-487。通常可在卩遼菌體基因組中發(fā)現(xiàn)這些活性。這是從細(xì)胞內(nèi)部溶解肽聚糖層。第四種情形為噬菌體感染需要肽聚糖屏障被穿越的情形，如Padmanabhan, et al.W02007/130655中所描述。這是從細(xì)胞外部降解肽聚糖層。這些活性作為噬菌體病毒粒子的組件被發(fā)現(xiàn)，且通常編碼于噬菌體基因組中。
[0047]這些機制的每一種都涉及一些拆解肽聚糖結(jié)構(gòu)的手段。因此，胞壁質(zhì)水解活性被發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌的真核宿主基因組中、細(xì)菌自己的基因組中，以及把細(xì)菌作為宿主的噬菌體(和相關(guān)的前噬菌體)中?？梢酝ㄟ^任何這些來源的同源物發(fā)現(xiàn)胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域，且可以使用信息學(xué)用它們各自的標(biāo)準(zhǔn)基序來確定候選基因。
[0048]可以將肽聚糖“降解活性”轉(zhuǎn)化成高效的殺菌活性，用于在治療情形下對抗革蘭氏陰性細(xì)菌病原體，且可以包含胞壁酰胺酶、葡萄糖酰胺酶、酰胺酶或肽鏈內(nèi)切酶活性?？梢詫⒌湫偷陌谫|(zhì)水解結(jié)構(gòu)域鑒定、整合到嵌合構(gòu)建體內(nèi)遞送至肽聚糖基質(zhì)、制備、純化和確認(rèn)具有針對有外膜細(xì)菌宿主的殺菌活性。包含此類活性的重組構(gòu)建體作為抗菌組合物和抗菌劑具有重要的有益性能。本發(fā)明的許多肽聚糖降解活性針對革蘭氏陰性菌或具有外膜的細(xì)菌，但其他的則具有目標(biāo)特異性，其可以包含革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的一種或兩種。兩種類型細(xì)菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)共有某些連接和結(jié)構(gòu)，其可能對選定的胞壁質(zhì)水解活性敏感。因此，可水解共有連接的胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域可能比不能水解共有連接的胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域具有更廣的目標(biāo)范圍。
[0049]本發(fā)明的連接多肽的實例使用了包含來自假單胞菌噬菌體P134的溶菌酶結(jié)構(gòu)域的片段，噬菌體P134與噬菌體phiKMV密切相關(guān)。對應(yīng)于phiKMV內(nèi)0RF36的噬菌體P134內(nèi)0RF36可溶解外膜已被去除的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在去除外膜后將構(gòu)建體接觸多種不同的革蘭氏陰性細(xì)菌，導(dǎo)致細(xì)胞被破壞。這些結(jié)果證明，來自不同革蘭氏陰性細(xì)菌物種的肽聚糖對胞壁質(zhì)水解活性敏感。
[0050]序列同源性搜索可鑒定能被用作肽聚糖降解活性替代源的多種其他類似結(jié)構(gòu)域。展現(xiàn)這些活性的多肽的較小尺寸為有效的大規(guī)模生產(chǎn)提供了條件。提供了目標(biāo)細(xì)菌的相關(guān)細(xì)胞壁目標(biāo)組分，例如肽聚糖的可獲得性，其為基于體內(nèi)給藥的藥理學(xué)分布。
[0051]可以在以下分子內(nèi)發(fā)現(xiàn)相關(guān)的胞壁質(zhì)水解活性:溶菌酶樣超家族、溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶(LT)、鵝蛋白溶菌酶(GEWL);含有溶菌酶樣結(jié)構(gòu)域的超家族C100442，其含有多個成員包括可溶性溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶(SLT)、鵝蛋白溶菌酶(GEWL)、雞蛋白溶菌酶(HEWL)、殼多糖酶、λ噬菌體溶菌酶、內(nèi)溶素、自溶素、殼聚糖酶。所有這些成員都涉及β-1，4-連接多糖的水解。在噬菌體內(nèi)溶素和細(xì)菌自溶素中發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)結(jié)構(gòu)域。含有CHAP結(jié)構(gòu)域的多數(shù)蛋白可充當(dāng)肽聚糖水解酶，且通常與酸胺酶相關(guān)。參見 Bateman 和 Rawlings (2003) Trends Biochem.Sc1.5:234-237,以及Pritchard, et al.(2004) Microbio logy 150:2079-2087。也參見創(chuàng)立于 cazy.0rg 網(wǎng)站的Carbohydrate-Active enZYmes數(shù)據(jù)庫。CAZY數(shù)據(jù)庫描述了酶的結(jié)構(gòu)相關(guān)的催化和碳水化合物結(jié)合模塊(或功能域)的家族，這些酶可降解、修飾或制備糖苷鍵。肽鏈內(nèi)切酶的另一來源為來自創(chuàng)立于 merops.sanger.ac.uk/cgi_bin/clan_index?type=P 的網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫。表A提供了可用于本發(fā)明的具有肽聚糖降解活性的典型酶清單?？梢园l(fā)現(xiàn)其他類似的或同功的活性，其被類似地注釋、與清單中的成員共享特征基序或同源。
[0052]表A:胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(MD)源
[0053]
描述詳細(xì)說明_
體顆粒,,該f海邛水解原核細(xì)胞璧的狀聚糖雜聚物中N-乙酰
_-D-葡萄糖胺和N-乙醃胞壁酸之間的1，4-p連接_
C型溶菌酶/α-乳白蛋白家族 C型溶菌驂為分泌的溶菌酶，其可切割細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚
糖,，結(jié)構(gòu)為多結(jié)構(gòu)域、混合的α和p折疊，含有4個保守
_的二硫健,,_
基因25祥溶菌酶該家族包括來自Τ4的噬菌體蛋白基因25,其為具有酸性
_溶鋳酶活性的基片外楔突的結(jié)構(gòu)組件。_
Α1前舦大多數(shù)真核狀鏈I*)切S$(Merops家族A1)可用信號分子和
前狀合成。該動物性胃發(fā)白翁樣肽鏈內(nèi)切峰前肽形成了獨
_特的前肽家族，其含有約30殘基長的保守基序?_
前噬菌體肽鏈內(nèi)切騰尾該家族為可餘起著肽健內(nèi)切聲作用的前噬菌體尾蛋白(例
如:來自單核細(xì)Ifei#生性李斯特菌(Zls?erifl monocytogenes)
_的前噬鋳體尾資白gp!8(NP—465809.1).._
Rcprolysin (M12B)家族辭金屬蛋該家族的成員為可切割狀類的酶,，這些蛋白_需要鋅來催白騰化，該家族的成員也稱為Adamalysin.該家族的大多數(shù)成
員為蛇毒狀鏈內(nèi)切，但也存在一些諸如Ρ78325和受f |
_素的哺乳動物I白,,_
來自噬菌體的病毒粒子相關(guān)胞壁|
[0054]
【權(quán)利要求】
1.嵌合多肽，包含:(i)胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(MD),其來自能溶解經(jīng)氯仿處理過的綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的病毒體相關(guān)胞壁質(zhì)水解酶或該胞壁質(zhì)水解酶的變體；和(ii)跨膜結(jié)構(gòu)域(MTD)，其包含SEQID N0:4的16-39位氨基酸序列或DAS譜為1.2-2.6的該氨基酸序列的變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中1-lOOnmol的MD在CFU下降試驗中溶解至少50%的107個經(jīng)氯仿處理過的綠膿桿菌。
3.嵌合多肽，包含:(i)胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(MD)，包含SEQID NO: 2的737-875位氨基酸序列或該氨基酸序列的變體，且其能溶解經(jīng)氯仿處理過的革蘭氏陰性菌；和(ii)跨膜結(jié)構(gòu)域(MTD)，其具有1.5-3的DAS譜且能穿越綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的外膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嵌合多肽，其中1-lOOnmol的MTD穿越至少50%的107個綠膿桿菌的膜。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MD包含SEQID N0:2的737-875位氨基酸序列或者有1個、2個或3個甲硫氨酸被非甲硫氨酸氨基酸替換的變體。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MD包含SEQID N0:2的683-889位氨基酸序列或者有1-7個甲硫氨酸被非甲硫氨酸氨基酸替換的變體。`
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MTD包含SEQID NO:4的16-39位氨基酸序列或者有1-6個疏水性氨基酸被親水性分?jǐn)?shù)為_2或更低的氨基酸替換的變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合多肽，其中SEQID NO:4的V20、V22和124被親水性分?jǐn)?shù)為_2或更低的氨基酸替換。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MTD的DAS譜低于2.5。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽的DAS譜低于2.5o
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MTD和MD由包含3-5個帶正電荷的氨基酸的連接臂連接。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MD包含與SEQID N0:2的737-875位氨基酸具有至少90%相同性的序列，且所述MTD包含與SEQ ID N0:4的16-39位氨基酸具有至少80%相同性的序列。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含與選自以下的序列具有至少90%相同性的序列:SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 13。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQIDNO: 11的序列。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQIDNO: 13的序列。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽被連接到聚乙二醇上。
17.藥物組合物，其包含前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
18.抑制個體內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，包括將權(quán)利要求17所述的藥物組合物給予到個體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)菌選自:綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、月市炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis)、志賀氏菌(Shigella)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)和泰國伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)。
20.抗菌劑，包含前述權(quán)利要求中任一項所述的嵌合多肽和減少氧化作用的藥劑。
21.抑制環(huán)境中細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，包括將權(quán)利要求1-16中任一項所述的嵌合多肽應(yīng)用到所述環(huán)境中。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)菌選自:綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、月市炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis)、志賀氏菌(Shigella)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)和泰國伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)。
23.嵌合多肽，包含:(i)胞壁質(zhì)水解結(jié)構(gòu)域(MD)，其 選自表A中列出的MD源或這些MD源的變體；和(ii)膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(MTD)，其選自表B中列出的MTD源或DAS譜為1.2-2.6的這些MTD源的變體，其中相比未處理的對照培養(yǎng)物，所述嵌合多肽減少革蘭氏陰性菌培養(yǎng)物的CFU。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的嵌合多肽，其中Ι-lOOnmol的嵌合多肽在CFU下降試驗中溶解至少50%的107個革蘭氏陰性菌。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的嵌合多肽，其中所述細(xì)菌選自:綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、嬰兒沙門氏菌(Salmonella infantis)、志賀氏菌(Shigella)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)和泰國伯克氏菌(Burkholderiathailandensis)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項所述的嵌合多肽，其中所述MTD包含選自以下的序列:SEQ ID NO:4 的 16-39 位氨基酸；SEQ ID NO: 15 的 242-264 位氨基酸；SEQ ID NO: 17 的242-271 位氨基酸；SEQ ID NO: 19 的 220-406 位氨基酸；SEQ ID NO:21 的 220-400 位氨基酸；SEQ ID NO:23的220-885位氨基酸和DAS譜為1.2-2.6的以上序列的變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26中任一項所述的嵌合多肽,其中所述嵌合多肽包含與選自以下的序列具有至少90%相同性的序列:SEQ ID N0s:9、ll、13、15、17、19、21和23。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽被連接到聚乙二醇上。
29.藥物組合物，其包含權(quán)利要求23-28中任一項所述的嵌合多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
30.抑制個體內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，包括將權(quán)利要求29所述的藥物組合物給予到個體。
31.抗菌劑，其包含權(quán)利要求23-28中任一項所述的嵌合多肽和減少氧化作用的藥劑。
32.抑制環(huán)境中細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，包括將權(quán)利要求23-28中任一項所述的嵌合多肽應(yīng)用到所述環(huán)境中。`
【文檔編號】C12P21/06GK103635584SQ201280026193
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月12日
【發(fā)明者】C·B·阿巴艾亞, 斯里拉姆·帕德馬納博汗, R·桑吉弗·薩拉瓦納恩, 巴拉?！の魅鹛m姆 申請人:岡戈根股份有限公司