用于對(duì)hpv感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多肽及其篩選方法、制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多肽，其特征在于，由四個(gè)HPV表位肽C?端的羧基與三個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的多聚精氨酸骨架的氨基連接而形成，所述表位肽的氨基酸序列為，Tyr?Met?Leu?Asp?Leu?Gln?Pro?Glu?Thr?Gly?Gly?Gly。本發(fā)明還提供了所述樹(shù)狀多肽的篩選制備方法，以及應(yīng)用。本發(fā)明利用多種組合生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)和分析，提高了發(fā)現(xiàn)新抗原表位的能力，使負(fù)載表位肽的朝向具有一致性，在單位空間內(nèi)指數(shù)級(jí)增加了表位肽的特異性結(jié)合能力和反應(yīng)敏感性。本發(fā)明的表位肽結(jié)構(gòu)與性質(zhì)單一，具有特異性高、無(wú)潛在生物危害性、制備工藝可標(biāo)準(zhǔn)化等巨大優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】
用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多肽及其篩選方法、制備 方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及宮頸癌的防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù) 狀多肽及其篩選方法、制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是女性最常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。我國(guó)是 宮頸癌高發(fā)國(guó)家，特別是近年來(lái)年輕宮頸癌患者有明顯上升趨勢(shì)，發(fā)病率以每年2 %-3 %速 度增長(zhǎng)。人乳頭瘤病毒〇1111]^11口3口；[101]^￥；[1'118，即\0可引起良、惡性增生，特別是高危型!^￥ 與宮頸癌的關(guān)系密切。目前，對(duì)宮頸癌的治療多采用手術(shù)、化療、放療、生物治療和中醫(yī)療法 聯(lián)合應(yīng)用。這些療法的共同缺陷是缺乏特異，對(duì)正常組織細(xì)胞損傷大，毒副作用大，不但療 效不能滿意，而且醫(yī)療費(fèi)用巨大。近年來(lái)，主動(dòng)的、特異的細(xì)胞免疫治療因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)將 成為宮頸癌治療的理想手段。
[0003] 隨著免疫識(shí)別理論、分子生物學(xué)知識(shí)和電子顯微技術(shù)的不斷進(jìn)展與突破，大量研 究證實(shí)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞對(duì)于抗原的識(shí)別是與MHC分子結(jié)合遞呈的抗原短肽。即當(dāng)外源性抗原被抗 原呈遞細(xì)胞捕獲后，蛋白質(zhì)抗原在內(nèi)吞系統(tǒng)被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T細(xì) 胞表位與MHC I類分子結(jié)合，被轉(zhuǎn)運(yùn)至APC表面供T細(xì)胞受體識(shí)別，從而激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答， 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多肽，可 應(yīng)用于致敏體外培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞，使其攜帶抗原信息，致敏后的樹(shù)突狀細(xì)胞可用于治療 高危型人乳頭瘤病毒感染的宮頸癌。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多肽，由四個(gè)HPV表位肽C-端的羧基與三 個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的精氨酸骨架的氨基連接而形成，所述樹(shù)狀多肽具有以下結(jié)構(gòu)式：
[0007]
[0008]其中，R為精氨酸殘基，X為所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列為T(mén)yr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly〇
[0009]進(jìn)一步地，所述表位肽的N端有棕櫚酰絲氨酸修飾。
[0010] 進(jìn)一步的，所述表位肽采用SYFPEITHI遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)、PREDEPP數(shù)據(jù)庫(kù)、基序法和 多項(xiàng)式法共同對(duì)HPV16 E7編碼蛋白進(jìn)行HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)得到。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的樹(shù)狀多肽，采用固相合成法制備進(jìn)行制備。
[0012] 進(jìn)一步的，通過(guò)多聚精氨酸骨架將上述表位肽連接成4分枝狀多聚抗原肽。
[0013] 進(jìn)一步的，選擇棕櫚酰絲氨酸以-AAA-柔性連接的方式進(jìn)行T細(xì)胞表位肽的修飾。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的樹(shù)狀多肽，應(yīng)用于致敏樹(shù)突狀細(xì)胞，或應(yīng)用于制備優(yōu)勢(shì)表位肽疫 苗。
[0015] 進(jìn)一步的，所述優(yōu)勢(shì)表位肽疫苗和優(yōu)勢(shì)表位肽致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞應(yīng)用于治療高危 型人乳頭瘤病毒感染的宮頸癌。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用多種組合生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)和分析，極大地 提高了發(fā)現(xiàn)新抗原表位的能力，使負(fù)載表位肽的朝向具有一致性，在單位空間內(nèi)指數(shù)級(jí)增 加了表位肽的特異性結(jié)合能力和反應(yīng)敏感性。與病原微生物裂解物和重組蛋白比較，本發(fā) 明的表位肽分子量小，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)單一，具有特異性高、無(wú)潛在生物危害性、制備工藝可標(biāo) 準(zhǔn)化等巨大優(yōu)勢(shì)。
[0017] 基于T-DC的細(xì)胞治療可以重建宮頸局部的免疫應(yīng)答，靶向性的深入病變局部，清 除癌變細(xì)胞或被感染細(xì)胞內(nèi)的HPV，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)任何殺傷作用。重建宮頸局部免疫能力， 從而達(dá)到徹底殺滅、清除病毒的目的，修復(fù)受損上皮細(xì)胞和局部組織，進(jìn)一步使難以治愈、 反復(fù)發(fā)作的宮頸疾病消失，從而有效的阻斷了宮頸粘膜從癌前病變的各階段向?qū)m頸癌階段 的發(fā)展。啟動(dòng)感染局部組織對(duì)HPV的特異性清除，修復(fù)受損的上皮細(xì)胞和局部組織。同時(shí)，可 以在體內(nèi)形成長(zhǎng)期免疫記憶，加強(qiáng)免疫防治效果，為防止復(fù)發(fā)或再感染提供長(zhǎng)期保護(hù)
[0018] 通過(guò)多聚精氨酸骨架將上述表位肽連接成4分枝狀多聚抗原肽，增加了分子量和 生物活性，使連接的表位肽的朝向具有一致性，在單位空間內(nèi)指數(shù)級(jí)增加了表位肽的特異 性結(jié)合能力和反應(yīng)敏感性。
[0019] 甘氨酸的增加可提高肽的免疫調(diào)節(jié)作用，增加免疫活性。在T細(xì)胞表位的N-末端加 上棕櫚?；梢栽黾有》肿与脑诩?xì)胞膜上的定位、跨膜及穿透能力。為了提高T細(xì)胞表位通 過(guò)外源性途徑引發(fā)CTL反應(yīng)的能力，我們選擇了棕櫚酰絲氨酸以-AAA-柔性連接的方式進(jìn)行 T細(xì)胞表位肽的修飾。相對(duì)無(wú)修飾的對(duì)照組，經(jīng)修飾后的表位肽可使細(xì)胞活性呈現(xiàn)極顯著升 尚(p〈0·01)〇
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0021] 一、表位肽的設(shè)計(jì)與篩選
[0022] 1.人乳頭瘤病毒抗原及其同源性分析
[0023] HPV16、18型是最常見(jiàn)的高危型，是宮頸癌及其癌前病變的主要致病因子。特別是 HPV16型在宮頸癌組織中的檢出率超過(guò)50%，在宮頸癌的發(fā)生中起著重要作用。研究表明， HPV16 E7蛋白是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要癌蛋白，通過(guò)結(jié)合并失活腫瘤抑制蛋白R(shí)b而發(fā)揮轉(zhuǎn)化 作用。
[0024]從Genebank中選擇HPV16 E7蛋白，其98個(gè)氨基酸序列：MHGDT PTLHE YMLDT QPETT DLYCY EQLND SSEEE DEIDG PAGQA EPDRA HYNIV TFCCK CDSTL RPLCVQ STHVD IRTLE DLLMG TLGIV CPICS QKP，將E7蛋白氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白片段進(jìn)行Blast，以 確定該段蛋白質(zhì)的特異性。
[0025] 2、HPV16 E7抗原的一般特性預(yù)測(cè)
[0026] 應(yīng)用軟件CLC Protein Workbench3版本和Signal P3.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)， 包括疏水性、親水性、抗原性、跨膜結(jié)構(gòu)域、等電點(diǎn)及信號(hào)肽潛在切割位點(diǎn)。
[0027] 本發(fā)明采用SYFPEITHI遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)、PREDEPP數(shù)據(jù)庫(kù)、基序法和多項(xiàng)式法共同 對(duì)HPV16 E7編碼蛋白進(jìn)行HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)。
[0028] 3、利用SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CTL表位初步預(yù)測(cè)
[0029] 4、通過(guò)PREDEPP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行MHCI類結(jié)合基序預(yù)測(cè)。
[0030] 5、基序法
[0031] (1)不同的MHCI類對(duì)所結(jié)合的肽的組成有不同的要求，但其中起主要作用進(jìn)而對(duì) 肽鏈與MHCI類分子的結(jié)合有重要影響的是肽鏈的兩個(gè)主要錨點(diǎn)殘基，他們?cè)诙嚯呐cMHCI類 分子的高親和力結(jié)合中是必需的。
[0032] (2)二級(jí)錨點(diǎn)殘基的作用除了兩個(gè)主要錨點(diǎn)殘基的必需因素外，多肽鏈中的其他 氨基酸殘基對(duì)多肽與HLA-A2分子的高或中等親和力結(jié)合也有不可忽視的影響。在其他位置 上，不同氨基酸殘基對(duì)多肽與HLA-A2分子的結(jié)合有著不同的影響，有的氨基酸殘基有利于 結(jié)合，而有的則不利于結(jié)合。理想的與HLA-A2結(jié)合的CTL表位(即有高的或中等親和力)應(yīng)不 包含不利于結(jié)合的氨基酸殘基，或有利于結(jié)合的殘基多于不利于結(jié)合的殘基。
[0033] 6、多項(xiàng)式方案預(yù)測(cè)表位肽
[0034]多項(xiàng)式方案是指當(dāng)某殘基R出現(xiàn)在某肽的第I位時(shí)，不考慮其他肽序列的情況下， 該殘基對(duì)于整個(gè)肽與MHCI類分子的結(jié)合自由能提供了一常量Ri，用在第I位為殘基R的大量 多肽的IC5Q的負(fù)loglO值的平均值來(lái)估計(jì)此常量。IC 5Q被定義為待測(cè)肽將對(duì)照肽-MHC復(fù)合物 中50 %的對(duì)照肽置換下來(lái)的濃度。將其所有氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的Ri值相加，選擇分值大于選 定閾值的抗原肽為可能的后選肽。
[0035] 將SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果和PREDEPP數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，篩選出作 為T(mén)細(xì)胞表位肽的可能性最大的5條肽：TLHEYMLDL(E7 7-15)、YMLDLQPET(E7 11-19)、 RAHYNIVTF(E7 49-57)、RLCVQSTHV(E7 66-74)、UMGTLGIV(E7 82-90)，再計(jì)算其多項(xiàng)式的 值，設(shè)定閾值，最終篩選出HLA-A2限制性CTL表位肽:YMLDLQPET(E7 11-19)，然后再運(yùn)用 Fmoc法固相合成優(yōu)勢(shì)表位肽。
[0036] 7、表位肽的修飾
[0037]為增加分子量和生物活性，使連接的表位肽的朝向具有一致性，增加免疫活性，增 加小分子肽在細(xì)胞膜上的定位、跨膜及穿透能力，對(duì)表位肽進(jìn)行以下修飾:在肽的c端增加 三個(gè)甘氨酸;選擇棕櫚酰絲氨酸以-AAA-柔性連接的方式進(jìn)行T細(xì)胞表位肽的修飾;通過(guò)多 聚精氨酸骨架將上述表位肽連接成4分枝狀多聚抗原肽。
[0038]二、DC細(xì)胞負(fù)載HPV優(yōu)勢(shì)表位肽后的功能研究
[0039] 1. CD14+的選擇和DC細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)及致敏
[0040] 采用白細(xì)胞分離法分離出患者外周血單核細(xì)胞，在向其中加入CD14微珠，通過(guò)陽(yáng) 性分選柱磁性分選⑶14+細(xì)胞，將通過(guò)⑶14+分選得到的細(xì)胞作為DC培養(yǎng);經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4處理后，細(xì)胞變成明顯的樹(shù)突狀。在第10天，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)，大部 分細(xì)胞表達(dá)輔助刺激分子標(biāo)記⑶86、CD40、⑶80和HLA-DR、MHC-I分子。在第11天用優(yōu)勢(shì)表 位肽沖擊DC細(xì)胞。
[0041 ] 2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
[0042] 2.1DC細(xì)胞對(duì)HPV肽吸收情況
[0043]用FITC對(duì)肽標(biāo)記，進(jìn)行細(xì)胞定位，采用共聚焦顯微法以確定DC細(xì)胞對(duì)HPV肽吸收情 況。分析顯示:30分鐘內(nèi)肽就會(huì)被DC細(xì)胞吸收。最初，在細(xì)胞體會(huì)看到熒光，細(xì)胞核看不到熒 光;2小時(shí)后，肽會(huì)經(jīng)由胞體擴(kuò)散到樹(shù)突；12小時(shí)后，在樹(shù)突和胞體檢測(cè)到熒光會(huì)逐漸消退。 在細(xì)胞核沒(méi)有觀察到熒光。說(shuō)明小分子肽不參與細(xì)胞的遺傳信息傳遞，這一現(xiàn)象提示我們 將表位肽作為疫苗，與DC共培養(yǎng)后回輸機(jī)體，應(yīng)該不會(huì)產(chǎn)生遺傳性疾病（繼發(fā)性傷害）。 2.2MTT檢側(cè)短肽對(duì)細(xì)胞活性的影響
[0044]采用MTT法檢測(cè)HPV優(yōu)勢(shì)表位肽致敏后DC刺激T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)。設(shè)置對(duì)照組 如下：未致敏DC+T細(xì)胞組、優(yōu)勢(shì)表位肽+T細(xì)胞組、優(yōu)勢(shì)表位肽致敏DC+T細(xì)胞組，以及空白對(duì) 照。結(jié)果顯示:DC具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用。而單純表位肽直接作用于T淋巴細(xì)胞不能 引起T細(xì)胞的明顯增殖，只能通過(guò)非特異性刺激引起T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增長(zhǎng)。而負(fù)載表位肽 的DC細(xì)胞能有效刺激T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，與其他對(duì)照組有顯著差異(p〈0.05)，
[0045] 2.3 ELISP0T檢測(cè) γ-IFN分泌
[0046] ELISP0T檢測(cè)經(jīng)負(fù)載表位肽DC刺激后的釋放γ -IFN的T細(xì)胞的頻數(shù)。所設(shè)立空白對(duì) 照，DC組、Τ細(xì)胞組及負(fù)載優(yōu)勢(shì)表位肽的DC細(xì)胞組。結(jié)果顯示：負(fù)載優(yōu)勢(shì)表位肽的DC細(xì)胞組相 對(duì)于空白對(duì)照，DC組、T細(xì)胞組的結(jié)果高出很多，說(shuō)明γ -IFN分泌。
[0047]三、負(fù)載HPV優(yōu)勢(shì)表位肽的DC細(xì)胞在宮頸癌細(xì)胞免疫治療中的臨床效果探討 [0048] 1.臨床收集60例宮頸癌患者，年齡31-65歲，平均發(fā)病年齡49歲。均經(jīng)人乳頭狀瘤 病毒PCR檢測(cè)確診。所有患者隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組兩組，治療組30例，對(duì)照組30例。 [0049] 2.方法
[0050]治療組通過(guò)血細(xì)胞成份分離機(jī)采集含有單核細(xì)胞的自體外周血60mL(必要需提前 皮下注射G-CSF進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)員），提取單個(gè)核細(xì)胞，加入誘導(dǎo)因子將單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)為DC細(xì) 胞，第9天用優(yōu)勢(shì)抗原表位肽活化致敏，第10天收集成熟的DC制備成細(xì)胞懸液，通過(guò)靜脈回 輸和局部注射兩種方式進(jìn)行治療。對(duì)照組以常規(guī)治療做空白對(duì)照。觀察治療前后HPV DNA轉(zhuǎn) 陰率、免疫功能變化、瘤體變化等指標(biāo)。
[0051] 3、結(jié)果
[0052] 3.1 PCR檢測(cè)HPV DNA
[0053]治療組和對(duì)照組分別于治療前及治療一個(gè)月后，采用人乳頭瘤病毒通用型引物， 取宮頸病變部位皮膚組織或局部分泌物，于PCR擴(kuò)增儀上做聚合酶鏈反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、 染色后紫外分析儀下觀察記錄結(jié)果:治療組HPV DNA轉(zhuǎn)陰19例，對(duì)照組轉(zhuǎn)陰者5例。顯示細(xì)胞 治療對(duì)HPV DNA的清除率高，效果明顯。
[0054] 3.2細(xì)胞免疫功能檢測(cè)
[0055]取治療前一周及治療結(jié)束一周取患者抗凝靜脈血2mL，進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測(cè)：CD3， ⑶4,⑶8,用Excel軟件分別對(duì)治療組與對(duì)照組患者治療前后數(shù)據(jù)做z檢驗(yàn).治療組治療前 ⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8較治療后⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8，兩組差異顯著(P〈0.05)免疫功能改 善明顯.而對(duì)照組治療前⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8與治療后⑶3，⑶4，⑶8，⑶4/⑶8比較，兩組 無(wú)顯著差異(P>〇.05)免疫功能改善不明顯。
[0056]
[0057]
[0058] 3.3瘤體變化
[0059]參照實(shí)體瘤療效RECIST判定標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)治療前和治療后一個(gè)月的CT和B超數(shù)據(jù)進(jìn) 行對(duì)照比較，治療組患者完全緩解9例，部分緩解11例，輕度緩解MR2例，總緩解率達(dá)73.3% ; 對(duì)照組患者完全緩解6例，部分緩解8例，輕度緩解MR2例，總緩解率53.3 %。治療組經(jīng)治療緩 解率高。
[0060]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多膚，其特征在于，由四個(gè)HPV表位膚c-端的簇 基與Ξ個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的多聚精氨酸骨架的氨基連接而形成，所述樹(shù)狀多膚具有W下結(jié) 構(gòu)式：其中，R為精氨酸殘基，X為所述表位膚，所述表位膚的氨基酸序列為T(mén)yr-Met-Leu-Asp- Leu-Gln-Pr〇-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于對(duì)HPV感染進(jìn)行細(xì)胞治療的樹(shù)狀多膚，其特征在于，所述 表位膚的N端有棟桐酷絲氨酸修飾。3. 篩選權(quán)利要求1或2所述的樹(shù)狀多膚的方法，其特征在于:所述表位膚采用SYFPEITHI 遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)、PREDEPP數(shù)據(jù)庫(kù)、基序法和多項(xiàng)式法共同對(duì)HPV16E7編碼蛋白進(jìn)行HLA-A2 限制性CTL表位預(yù)測(cè)得到。4. 制備權(quán)利要求1或2所述的樹(shù)狀多膚的方法，其特征在于:采用固相合成法制備進(jìn)行 制備。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備樹(shù)狀多膚的方法，其特征在于，選擇棟桐酷絲氨酸W- AAA-柔性連接的方式進(jìn)行T細(xì)胞表位膚的修飾。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備樹(shù)狀多膚的方法，其特征在于，通過(guò)多聚精氨酸骨架將上 述表位膚連接成4分枝狀多聚抗原膚。7. 權(quán)利要求1或2所述的樹(shù)狀多膚的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于致敏樹(shù)突狀細(xì)胞，或應(yīng)用 于制備優(yōu)勢(shì)表位膚疫苗。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的樹(shù)狀多膚的應(yīng)用，其特征在于，所述優(yōu)勢(shì)表位膚疫苗和優(yōu)勢(shì)表 位膚致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞應(yīng)用于治療高危型人乳頭瘤病毒感染的宮頸癌。
【文檔編號(hào)】C07K1/00GK106084008SQ201610431615
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】羅進(jìn), 閆小君
【申請(qǐng)人】江蘇安泰生物技術(shù)有限公司