利用膜片鉗技術(shù)篩選乳源中促睡眠肽粗提物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促睡眠保健品領(lǐng)域，特別是一種從乳源中分離純化促睡眠肽的方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]睡眠作為生命所必須的過程，是機(jī)體復(fù)原、整合和鞏固記憶的重要環(huán)節(jié)，是健康不可缺少的組成部分。世界衛(wèi)生組織的一項(xiàng)研究表明全球約有27%的人在遭受失眠病癥的困擾。在我國(guó)約有3億成年人患有失眠疾病。目前失眠癥在世界上仍是一個(gè)沒有得到充分重視和良好解決的公共衛(wèi)生問題。
[0003]臨床上常用化學(xué)合成類鎮(zhèn)靜催眠藥治療失眠及其他疾病引起的睡眠障礙。此類藥物在延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的同時(shí)，都會(huì)出現(xiàn)不同程度的副作用如頭暈、乏力、困倦、注意力不集中，甚至?xí)簳r(shí)性健忘和宿醉現(xiàn)象，并未真正起到改善睡眠質(zhì)量的作用。因此，提供藥效顯著、副作用小、安全的改善睡眠作用的藥物是醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。其中，建立快速、有效的改善睡眠作用藥物的藥效評(píng)價(jià)方法，對(duì)藥物進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)是實(shí)現(xiàn)這一任務(wù)的前提和基礎(chǔ)。
大腦中存在著由一系列神經(jīng)核團(tuán)纖維和遞質(zhì)所組成的睡眠、覺醒調(diào)節(jié)系統(tǒng)，彼此之間形成既有形態(tài)上聯(lián)系又有功能上制約的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。下丘腦內(nèi)視前區(qū)及其鄰近基底前腦神經(jīng)元為睡眠發(fā)生系統(tǒng)。視前區(qū)的促眠神經(jīng)元主要位于下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(VLPO)對(duì)睡眠的產(chǎn)生和維持有著至關(guān)重要的作用。
[0004]自1976年膜片鉗技術(shù)誕生以來(lái)，利用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行電生理學(xué)的研究已成為一種重要的研究手段。離體腦片是指從動(dòng)物腦區(qū)制備的腦組織薄片，可在體外人工腦脊液中存活數(shù)小時(shí)到十幾小時(shí)，并能保持與在體腦組織相似的代謝特性和電生理特性。本發(fā)明將腦片膜片鉗技術(shù)與紅外微分干涉相差技術(shù)相結(jié)合，建立紅外可視腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使離體腦片的電生理研究擴(kuò)大到下丘腦、大腦皮層、小腦、海馬、紋狀體、腦干等幾乎所有的腦區(qū)及脊髓薄片。
[0005]牛乳中含有多種生物活性多肽，天然牛乳中活性多肽的含量較少，無(wú)法滿足亞健康人們的需要。牛乳蛋白，是許多具有潛在生物活性物質(zhì)的前體，通過蛋白酶酶解作用，得到具有生物學(xué)功能的小肽，即乳源生物活性肽。這些小肽一般由2-20個(gè)氨基酸殘基組成，能夠?qū)C(jī)體的消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多方面產(chǎn)生積極的影響，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、抗菌、抗氧化、抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)等生理活性。牛奶制品長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為具有促進(jìn)睡目民，緩解壓力的作用，法國(guó)科學(xué)家已證實(shí)牛奶制品中的一種酪蛋白酶解產(chǎn)物具有明確的抗抑郁，緩解壓力的生物活性，但其具體機(jī)制和具體物質(zhì)一直沒有明確。
[0006]目前，國(guó)內(nèi)膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用并不廣泛，且以盲法為主，缺少高質(zhì)量的體視顯微鏡和水浸物鏡是一方面的原因，而主要難點(diǎn)是制備活性良好的腦片。另一方面，乳源制品具有調(diào)節(jié)睡眠的活性，但缺乏合適的模型對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]
本發(fā)明的目的在于提供一種利用膜片鉗技術(shù)篩選乳源中促睡眠肽粗提物的方法，其利用乳源多肽等電點(diǎn)(PH)、溶液極性(乙醇濃度)對(duì)其進(jìn)行粗分離，定量分析各性質(zhì)部分所占比例(沉淀得率)，并借助制備液相制備樣品，對(duì)酪蛋白酶磷酸肽副產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。所得粗提取不僅可以縮短入睡的時(shí)間，還可以調(diào)節(jié)睡眠節(jié)律，為失眠癥患者的健康提供更好的保障。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的實(shí)施方案為:一種利用膜片鉗技術(shù)篩選乳源中促睡眠肽粗提物的方法，包括以下步驟:
(1)在容器中加入水，升溫至40°c-60°c，加入牛乳和蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:水和牛乳體積比為100: 10-15、pH值7.5-8.5、時(shí)間2_4h，所述蛋白酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶，胰蛋白酶的加入量為牛乳質(zhì)量的0.2%-0.6%，胃蛋白酶的加入量為牛乳質(zhì)量的0.06%-
0.12%，酶解完成后，滅酶，噴霧干燥，得粉狀酪蛋白水解物；
(2)酪蛋白水解物通過等電點(diǎn)沉淀分離，條件為pH4.5-6、乙醇濃度60%-90%、沉淀時(shí)間為l_3h;
(3)采用反相鋼柱，將步驟(2)所得沉淀物通過制備液相，再次對(duì)樣品進(jìn)行分離純化，根據(jù)樣品極性的不同，將樣品分為若干段，通過建模，對(duì)該促睡眠粗體物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)；
(4)急性分離大鼠的下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)腦片，厚度約300-500um，然后采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，借助去極化方波，給予30-60PA，3000-4000mS誘發(fā)動(dòng)作電位，給藥100-150 ymol/L，記錄電生理圖譜，通過放電數(shù)目和頻率，篩選出具有較好促睡眠的活性片段。
[0009 ] 作為優(yōu)化，步驟(I)中，所述水和牛乳體積比為100:12。
[0010]作為優(yōu)化，步驟(I )中，所述酶解分兩步進(jìn)行，第一步:調(diào)節(jié)溶液pH 8，開攪拌300rpm，投入胰蛋白酶，酶解3h，滅酶，胰蛋白酶的加入量為牛乳質(zhì)量的0.3%;第二步:調(diào)節(jié)PH為5，加入胃蛋白酶，將溫度調(diào)到40°C，酶解2h，胃蛋白的加入量為牛乳質(zhì)量的0.1%。
[0011 ]作為優(yōu)化，步驟(I)中，所述滅酶溫度為90°C，時(shí)間30分鐘。
[0012]作為優(yōu)化，步驟(2)中，等電點(diǎn)沉淀?xiàng)l件為:pH5，乙醇濃度70%，沉淀3h后，4°C下靜置4小時(shí)。
[0013]本發(fā)明將成分復(fù)雜的酪蛋白水解產(chǎn)物采用簡(jiǎn)單的分離純化技術(shù)得到約20%的沉淀產(chǎn)物，操作簡(jiǎn)單，分離效果好;再借助制備液相，對(duì)促睡眠粗提物進(jìn)一步分離純化，上柱簡(jiǎn)單易操作，可以加大上樣量，制備較多樣品，方便后期的生產(chǎn)，同時(shí)降低生產(chǎn)成本;制備的樣品通過膜片鉗技術(shù)對(duì)其進(jìn)行促睡眠活性評(píng)價(jià)，將復(fù)雜多化的神經(jīng)元研究，簡(jiǎn)化為紅外可視腦片膜片鉗，借助神經(jīng)元的放電頻率、膜常熟、幅值等參數(shù)對(duì)下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元電生理指標(biāo)進(jìn)行睡眠指標(biāo)的相關(guān)研究，該評(píng)價(jià)模型具有普遍適應(yīng)性，不但可以評(píng)價(jià)神經(jīng)元的電生理特性，還可以借助離子通道來(lái)研究神經(jīng)元相關(guān)機(jī)理。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明具有較高促睡眠效果P3高效液相色譜圖；
圖2為本發(fā)明酪蛋白水解物高效液相色譜圖； 圖3為本發(fā)明大鼠下丘腦組織分離切片；