一種副球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種副球菌，已于2014年01月10日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8712。本發(fā)明篩選的菌用于生產(chǎn)巖藻聚糖硫酸酯酶、硫酸軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酸酶，可高效的降解巖藻聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸。
【專利說明】一種副球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種副球菌及其應(yīng)用，即一株具有巖藻聚糖硫酸酯酶、硫酸軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酸酶生產(chǎn)能力的細菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]巖藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)是一種高分子量的硫酸雜多糖，主要由L-巖藻糖及硫酸酯基團組成，還含有半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、糖醛酸等，主要來源于褐藻和棘皮類動物。研究發(fā)現(xiàn)它具有多種生理活性，包括抗凝血、抗血栓、提高免疫力、抗氧化等等，因此Fucoidan成為當今天然海洋活性物質(zhì)的主攻重點。但由于Fucoidan的分子量巨大，從幾萬到幾十萬都有，嚴重影響了它的吸收效率，同時Fucoidan還具有一定的粘性，也大大阻礙了它作為藥物的應(yīng)用。將高分子量的Fucoidan降解為低分子量的糖類，可以解決上述應(yīng)用難題，同時也是進行Fucoidan構(gòu)效研究的重要手段。目前對Fucoidan進行降解的最佳方法是酶解法，該方法特異性高，過程容易控制，目的產(chǎn)物含量高，功能性強。該酶主要來源于產(chǎn)酶微生物，目前國內(nèi)外對此類產(chǎn)酶微生物有幾篇報道，但還沒有商品化的酶制劑出現(xiàn)，主要是微生物的產(chǎn)酶能力尚未達到生產(chǎn)的要求。因此，尋找酶的高產(chǎn)菌株是目前拓展Fucoidan應(yīng)用的重要途徑。
[0003]硫酸軟骨素(Chondroition Sulfate, CS)是一種酸性粘多糖-糖胺聚糖，主要
是由葡萄糖醛酸和氨基己糖形成的雙糖單位交替連接而成的生物大分子，雙糖單位的數(shù)目通常在50-70個左右，相對分子量大約在5000-50000Da之間。該多糖在哺乳動物的結(jié)締組織中含量較多，如軟骨、韌帶、動物喉骨、鼻骨、肌膜、氣管和血管壁等。根據(jù)結(jié)構(gòu)中硫酸基的位置不同，可將硫酸軟骨素分為A、B、C、D、E、F、H等多種異構(gòu)體，目前作為藥用的主要是A和C異構(gòu)體。若分子中半乳糖上的硫酸基在4位上，稱硫酸軟骨素A或4-硫酸軟骨素；如果分子中半乳糖上的硫酸基在6位上，則稱為硫酸軟骨素C或6-硫酸軟骨素，一般所指的硫酸軟骨素是A和C異構(gòu)體的混合物。硫酸軟骨素具有較強的降血脂作用和緩沖抗凝血作用，臨床上主要用于防止冠心病和動脈粥樣硬化。新的研究發(fā)現(xiàn)表明，當硫酸軟骨素的分子量降低至2-10kDa時其藥效更為明顯，對防止動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效，因此制備低分子量的硫酸軟骨素是關(guān)鍵。同時將高分子量的CS降解為低分子量產(chǎn)物是闡明其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能關(guān)系的最有效途徑。目前低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復雜的設(shè)備和操作并且還會造成環(huán)境污染，酶解法需要的 條件溫和而且容易控制，是上述方法中最理想的一種。硫酸軟骨素裂解酶能特異地降解細胞外基質(zhì)成分中的糖胺多糖如透明質(zhì)酸、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、肝素等，降解產(chǎn)物是不飽和二糖及寡糖。目前國外主要從微生物中提取硫酸軟骨素裂解酶來獲得高純度的酶制劑，已報道的產(chǎn)該酶的菌株主要有普通變形桿菌(Proteus vulgaris),肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)等。
[0004]透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase)是對催化降解透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)的酶的通稱，根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用機制的不同，將它們分為3類:(2)氨基葡糖苷酶(EC3.2.1.35)，作用于β_1，4糖苷鍵，是一種水解酶，終產(chǎn)物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素；(2)氨基葡糖苷酸酶(EC3.2.1.36)，作用于β _1，3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產(chǎn)物是四糖，特異性降解透明質(zhì)酸。(3)透明質(zhì)酸裂解酶(EC4.2.2.1)，作用于β_1，4糖苷鍵，通過β-消去機制得到4，5不飽和雙糖。最近十幾年來，人們對HA和透明質(zhì)酸酶顯示出了濃厚的興趣，研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶可通過降解組織中的ΗΑ，增加膜的通透性，促進注射液的擴散，因此它可以應(yīng)用于治療過程，以促進注射液吸收，提高局麻效果，并防止皮下及肌肉組織的破壞。在基礎(chǔ)研究方面，透明質(zhì)酸酶也是很好的工具酶，可用于多糖的研究以及寡聚多糖的制備。越來越多的證據(jù)表明，相對分子質(zhì)量低的HA的生物活性與HA顯著不同，近年很多研究人員都開始進行酶法降解HA制備寡糖的研究，從而可以進一步對其生物學意義進行探討。而微生物是獲取透明質(zhì)酸酶最佳來源，目前已經(jīng)報道的具有該酶生產(chǎn)能力的革蘭氏陰性細菌主要有氣單胞菌(Aeromonas),擬桿菌(Bacteroides),梭菌(Fusobacterium)以及弧菌(Vibrio)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種副球菌及其應(yīng)用，即一種同時具有巖藻聚糖硫酸酯酶、硫酸軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酸酶生產(chǎn)能力的細菌及其所生產(chǎn)的酶，可有效降解巖藻聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸，為更好的實現(xiàn)三種多糖的應(yīng)用及構(gòu)效研究提供了有效方法。
[0006]本發(fā)明的副球菌(paracoccus sp.)MD2,該菌株已于2014年01月10日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8712。
[0007]本發(fā)明篩選的菌用于生產(chǎn)巖藻聚糖硫酸酯酶、硫酸軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酸酶；
[0008]本發(fā)明篩選的菌用于降解巖藻聚`糖硫酸酯、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸。
`[0009]本發(fā)明的副球菌屬細菌MD2的活菌用于制備菌液；所制得的菌液可以用于提取胞內(nèi)酶，從而用于降解巖藻聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:胞內(nèi)酶降解CSA不同時間的電泳結(jié)果圖，其中:S、用硫酸軟骨素ABC酶降解CSA反應(yīng)24h的產(chǎn)物；E、胞內(nèi)酶；CSA、硫酸軟骨素；3h，5h，7h，10h，24h、用胞內(nèi)酶降解CSA分別反應(yīng)3h，5h，7h，IOh，24h的產(chǎn)物。
[0011]圖2:硫酸軟骨素A酶解產(chǎn)物的高效液相色譜-質(zhì)譜分析總離子流譜圖。
[0012]圖3:透明質(zhì)酸酶解產(chǎn)物的高效液相色譜-質(zhì)譜分析總離子流譜圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0014]一、副球菌的篩選
[0015]對青島市麥島海域的海水樣品進行微生物富集、初篩、復篩，篩選產(chǎn)酶菌。對產(chǎn)酶菌進行液體培養(yǎng)，收集微生物菌體并提取胞內(nèi)酶。
[0016]具體技術(shù)方案如下:
[0017](I)微生物富集培養(yǎng):無菌條件下取海水樣品2.5mL接入50mL富集培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%,蛋白胨1%,硝酸銨1.6mg/mL,磷酸氫二鈉8mg/mL,用過膜海水配制，pH自然)進行培養(yǎng)，在25°C，150rpm的恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束后，取上述富集培養(yǎng)液
2.5mL接入富集培養(yǎng)基重復富集兩次。
[0018](2)產(chǎn)酶微生物初篩:將富集培養(yǎng)液稀釋后，涂布于選擇性培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸銨5mg/mL，瓊脂2%，用過膜海水配制，pH自然)平板上，在25°C培養(yǎng)5天。將平板中所有形態(tài)不同的單菌落，進行純化培養(yǎng)，再接入斜面培養(yǎng)基(2216E瓊脂，用蒸餾水配制，PH自然)，于25°C培養(yǎng)至長滿斜面置于4°C冰箱保存。
[0019](3)產(chǎn)酶微生物復篩:將上述斜面菌種分別接種至15mL液體培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%,蛋白胨1%,硝酸銨5mg/mL,用過膜海水配制,pH自然)，于25°C, 180r/min的搖床培養(yǎng)，用次甲基藍法測定多糖含量。結(jié)果獲得一株菌MD2，培養(yǎng)72小時后多糖含量下降達到51%。
[0020](4)產(chǎn)酶菌MD2的形態(tài)、生理生化和分子生物學鑒定:將產(chǎn)酶菌劃線接種于2216E瓊脂平板，光學顯微鏡觀察細菌形態(tài)和生理生化鑒定菌落特征為菌落呈白色，圓形隆起狀，不透明，表面濕潤，邊緣整齊，細胞革蘭氏染色陰性，16S rDNA進行的分子生物學鑒定屬于副球菌屬(Paracoccus sp.)。菌株在2216E瓊脂平板上25°C培養(yǎng)24h后，菌落呈白色，圓形隆起狀，不透明，表面濕潤，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性。將該菌涂布于2216E瓊脂平板上，25°C培養(yǎng)24-48小時即長出 單菌落。該菌株已于2014年01月10日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8712。
[0021]二、副球菌菌液的制備
[0022]將保藏編號為CGMCC N0.8712的副球菌MD2接種于液體培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%，蛋白胨1%，硝酸銨5mg/mL，用過膜海水配制，pH自然)中，25°C、180rpm條件下培養(yǎng)12h，獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按5%接種量接種于新鮮的液體培養(yǎng)基，于25°C、150rpm條件下培養(yǎng)72h，即得副球菌菌液。
[0023]三、副球菌胞內(nèi)酶的制備
[0024]將副球菌MD2的菌液于4 °C、10000 X g離心5-10分鐘，棄上清，取沉淀，用少量20mM、pH8.0的Tris-HCl溶液溶解沉淀，在冰浴保護下，500w條件進行超聲波破碎細胞15min,于4°C離心IOmin,棄沉淀,上清即為胞內(nèi)酶,4°C保存。
[0025]四、副球菌產(chǎn)酶能力及降解多糖能力的檢測
[0026]1、副球菌產(chǎn)酶及降解巖藻聚糖硫酸酯的能力檢測
[0027]實施例1:
[0028]取胞內(nèi)酶與0.2%的Fucoidan (pH8.0、20mM的Tris-HCl溶解)等體積混合，于250C、120rpm搖床振蕩培養(yǎng)2小時，以鐵氰化鉀法測定還原糖含量。I個酶活力單位定義為25°C、pH8.0條件下，每小時產(chǎn)生的I納摩爾還原糖需要的酶量。經(jīng)測定，副球菌培養(yǎng)72h后產(chǎn)酶活力達到150U/mL。
[0029]實施例2:[0030] 將產(chǎn)酶菌MD2接種于液體培養(yǎng)基(Fucoidan0.2%，硝酸銨0.2%，用過膜海水配制，pH自然)，在25°C、150rpm條件下培養(yǎng)72h，每24h在無菌條件下取樣lmL，在80°C滅酶15min,于1000Orpm離心IOmin取上清液。以高效凝膠排阻色譜(色譜條件如下:AglientllOO 高效液相色譜儀；TSK-gel G3000PWX1 (30cmX7.5mm)色譜柱;40°C柱溫；
0.2M NaCl為流動相；0.5mL/min流速；示差檢測器)檢測多糖分子量的變化。結(jié)果表明培養(yǎng) 0h、24h、48h、72h 后，保留時間為 13.6min 的 Fucoidan 含量分別為 100%、78%、45%、30%。證明本發(fā)明篩選的菌株具有很好的降解巖藻聚糖硫酸酯的性能。
[0031 ] 2、副球菌產(chǎn)酶及降解硫酸軟骨素的能力檢測
[0032]實施例3:
[0033]取ImL胞內(nèi)酶與ImL0.2%的硫酸軟骨素A (CSA)(用pH8.0、20mM的Tris-HCl溶解)等體積混合，于37°C反應(yīng)60min，然后經(jīng)過100°C水浴5min終止反應(yīng)。在232nm測定樣品的紫外吸收?？瞻诪橄葴缑负笤龠M行反應(yīng)。I個酶活力單位定義為37°C條件下，每分鐘催化生成I微摩爾雙糖需要的酶量。經(jīng)測定，副球菌培養(yǎng)72h后產(chǎn)胞內(nèi)酶活力達到2.1U/
mLo
[0034]實施例4:
[0035]取100 μ L20mg/mL 的 CSA (用 20mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 配制)加入 2mL 離心管中，然后加入胞內(nèi)酶200yL，混勻，置于28°C、110r/min的恒溫振蕩器中，反應(yīng)24h。在反應(yīng)進行3h、5h、7h、10h、24h時，分別取出20μ L，在100°C干燥箱中滅酶lOmin，然后于1000Or/min離心5min，取上清液。對上述樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，條件如下:濃縮膠濃度5%，分離膠濃度15% ，在室溫恒壓200V進行電泳約30min。電泳結(jié)束后用0.5%阿利新藍(溶于2%乙酸溶液)進行染色30min，再用2%乙酸溶液脫色。電泳結(jié)果見附圖1，從圖中看出酶解3、5、7、10、24h均會出現(xiàn)寡糖片段，隨著酶解時間的延長，CSA含量逐漸減少，寡糖含量逐漸增加。表明菌株MD2產(chǎn)生的胞內(nèi)酶對CSA有顯著的降解效果。
[0036]實施例5:
[0037]取100 μ L20mg/mL 的 CSA (用 20mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 配制)加入 2mL 離心管中，然后加入胞內(nèi)酶200 μ L，混勻。置于28°C、110r/min的恒溫振蕩器中，反應(yīng)24h。在反應(yīng)進行3h、5h、7h、10h、24h時，分別取出20yL，在100°C干燥箱中滅酶lOmin，然后于10000r/min離心5min，取上清液。采用離子配對高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析酶解產(chǎn)物，條件如下:高效液相色譜儀(AgilentllOOcapillary LC),色譜柱(Agilent ZORBAXSB-C180.5mmX 250mm, 5 μ m)。流動相A:15mM正戊胺水溶液，ρΗ7.0 ;流動相B:75%的乙腈水溶液，含15mM正戊胺，ρΗ7.0。樣品濃度10 μ g/μ L (用流動相A溶解)，上樣量2 μ L。先用流動相A洗脫5min，再用流動相B (16 - 56%)進行線性梯度洗脫65min。酶解產(chǎn)物經(jīng)過離子配對高效液相色譜進行分離，然后進入質(zhì)譜進行分析，分離分析結(jié)果見附圖2、附表1。復雜的硫酸軟骨素A酶解產(chǎn)物在離子配對反相色譜柱上被很好的分離開，質(zhì)譜分析結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物主要是聚合度為2-22的不飽和偶數(shù)糖，基本結(jié)構(gòu)為ΛΑΝ(AN)n ( ΛΑ代表含有不飽和雙鍵的葡萄糖醛酸，A代表葡萄糖醛酸#代表乙酰氨基半乳糖，n=0-10)，含有一個不飽和雙鍵，由葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖的重復二糖單元組成，每個單糖上有I個硫酸根。說明該菌株MD2所產(chǎn)的胞內(nèi)酶為硫酸軟骨素裂解酶，能夠裂解硫酸軟骨素的β-1，4糖苷鍵，在非還原端的糖醛酸的碳4和碳5位之間脫水形成了一個不飽和雙鍵，從而生成葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖的重復二糖組成的偶數(shù)糖。
[0038]表1:硫酸軟骨素A酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種副球菌，其特征在于，所述的副球菌為paracoccus sp.MD2,于2014年01月10日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8712。
2.權(quán)利要求1所述的副球菌在生產(chǎn)巖藻聚糖硫酸酯酶、硫酸軟骨素裂解酶和透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酸酶中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的副球菌用于降解巖藻聚糖硫酸酯。
4.權(quán)利要求1所述的副球菌用于降解硫酸軟骨素。
5.權(quán)利要求1所述 的副球菌用于降解透明質(zhì)酸。
【文檔編號】C12N9/42GK103834593SQ201410077382
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】王瑩, 趙雪, 李八方, 王雪迎 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學