檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片和試劑盒。本發(fā)明基因芯片和檢測試劑盒和檢測方法可以準(zhǔn)確、有效的檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時短，檢測快速，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片以 及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片以及檢 測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄動 物的一種急性，熱性，高度傳染性疫病，主要特征是在口腔粘膜、蹄部、乳房、皮膚出現(xiàn)水皰， 繼而發(fā)生潰瘍的一類傳播速度極快的傳染病。該病嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)，影響國際貿(mào)易和 國家聲譽(yù)，受到了各國政府的普遍關(guān)注，被國際獸疫局列為法定通報的動物傳染病，我國將 其列為一類重大動物疫病之首。FMD易感動物包括牛、綿羊、山羊、胳駝和豬等 70多種家養(yǎng) 和野生偶蹄類動物。該病曾在全球范圍廣泛流行，給世界養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近 年來，我國曾發(fā)生過〇型、A型、Asial型3個血清型的FMD疫情：2005年?2007年發(fā)生多 起Asial型口蹄疫疫情；2009年武漢、上海和北京發(fā)生A型FMD疫情；2009年和2010年在 中國臺灣與香港自治區(qū)相繼發(fā)生0型FMD疫情，在2010年廣東省廣州市的白云區(qū)發(fā)生〇型 FMD疫情，至2010年末我國大陸的9個省的18個地方發(fā)生0型FMD疫情。此外，在健康牛 群中發(fā)現(xiàn)有帶毒情況。我國周邊的印度、越南、阿富汗等國家FMD流行情況比較復(fù)雜，國外 毒株多次傳入我國，對我國FMD的防控造成巨大的威脅。FMD傳染性強(qiáng)，危害巨大，快速、準(zhǔn) 確的診斷對FMD的防控具有重要意義。
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 又稱豬監(jiān)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRSV)，引起豬的高度接觸性傳染病。按臨床表現(xiàn)的不同可分為經(jīng)典豬藍(lán)耳病 和高致病性豬藍(lán)耳病。經(jīng)典豬藍(lán)耳病以母豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和仔豬呼 吸綜合征為特征；高致病性豬藍(lán)耳病以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實(shí)變和母豬繁殖障 礙為特征，仔豬、育肥豬和成年豬均可發(fā)病和死亡，其中仔豬發(fā)病率可達(dá) 100 %，死亡率可達(dá) 5〇%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)3〇%以上。我國2008年新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名 錄》將高致病性豬藍(lán)耳病列為一類動物疫病。目前，該病已廣泛流行于世界上所有養(yǎng)豬的國 家和地區(qū)，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病。 PRRSV自上世紀(jì)90年代傳入我國以來，給養(yǎng)豬業(yè)造 成了巨大的損失，特別是20〇6年下半年爆發(fā)的高致病性豬藍(lán)耳病 （HPRRSV)疫情，造成了巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國pRRSV流行毒株主要為美洲型，經(jīng)典株和高致病性變異株均在豬 群中廣泛存在。
[0004] 口蹄疫（FMD)和豬藍(lán)耳?。ㄘi繁殖與呼吸綜合征，PRRS)可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 對·$ 3個病的防控是豬群疫病防控的重點(diǎn)和首要任務(wù)。對發(fā)病畜禽進(jìn)行及時準(zhǔn)確地診斷， λ量:開展動物疫病主動監(jiān)測，掌握畜禽疫病的感染情況，是采取科學(xué)防控措施的前提和基 礎(chǔ)，也是提，動物疫病科學(xué)防控水平的必然要求；同時，通過監(jiān)測，對病原學(xué)陽性動物進(jìn)行 凈化，可有效降低野毒污染，促進(jìn)畜禽健康。目前針對 FM〇v和pRRSV的病原學(xué)檢測方法已 有很多報道，對每個病單獨(dú)檢測，費(fèi)事、耗力，增加了檢測成本。生產(chǎn)中迫切需要敏感性高、 特異性強(qiáng)的高通量聯(lián)合檢測技術(shù)，以提高檢測效率，有效降低勞動強(qiáng)度，節(jié)約檢測成本。
[0005] 王小強(qiáng)，"用于診斷四種豬疫病病毒寡核苷酸芯片的研制"，西北大學(xué)，微生物學(xué)， 2007公開了同時檢測豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病毒（豬繁殖與呼吸 綜合征病毒）的基因芯片，該基因芯片檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的最低 檢測限分別是：口蹄疫病毒6個/mL，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒5 . 05X 102個/mL。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的、靈敏度高的同時檢測口蹄疫病毒和 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片和試劑盒。
[0007] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片，它包括固相載體 以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID N0 :5?7所示任意一個或者任意多 個基因片段和SEQ ID N0 :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段。
[0008] 基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多膚、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0009] 其中，它還包括陽性對照探針是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，陰性對照探針是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標(biāo)記了熒光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
[0010] 所述熒光染料是cy3熒光染料或Cy5熒光染料。
[0011] 所述固相載體為醛基化玻片。
[0012] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0013] 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒是美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0014] 所述美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒是美洲型高致病性豬藍(lán)耳病病毒或美洲型 豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株。
[0015] 本發(fā)明檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：它包 括權(quán)利要求1或2所述的基因芯片與擴(kuò)增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的 試劑，其中，擴(kuò)增口蹄疫病毒基因的試劑包括SEQ ID N0 :1?2所示引物對；擴(kuò)增豬繁殖與 呼吸綜合征病毒基因的試劑包括SEQ ID N0 :3?4所示引物對。
[0016] 所述引物對中，SEQ ID N0 :1、3所示上游引物與SEQ ID N0 :2、4所示下游引物的 摩爾比為1:10
[0017] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下游引物上標(biāo)記有熒光染料。
[0018] 所述熒光染料是cy3熒光染料或Cy5熒光染料。
[0019] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0020] 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒是美洲型豬藍(lán)耳病病毒。
[0021] 所述美洲型豬藍(lán)耳病病毒是美洲型高致病性豬藍(lán)耳病病毒或美洲型豬藍(lán)耳病經(jīng) 典毒株。
[0022] 本發(fā)明提供了 SEQ ID N0 :5?7所示任意一個或者任意多個基因片段，與SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段在制備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜 合征病毒的基因芯片中的用途。
[0023] 所述基因芯片還包括陽性對照探針是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，陰性對照探 針是SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標(biāo)記了熒光染料的SEQ ID N0:14所示的 基因片段。
[0024] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物對在制備同時擴(kuò) 增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑中的用途。
[0025] 本發(fā)明提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物對，與SEQ ID N0 : 5?7所示任意一個或者任意多個基因片段、SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多 個基因片段在制備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒中的用途；其中，2 對引物對為擴(kuò)增試劑，SEQ ID N0 :5?10所示基因片段為檢測探針。
[0026] 所述引物對中，SEQ ID N0 :1、3所示上游引物與SEQ ID N0 :2、4所示下游引物的 摩爾比為1:10。
[0027] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下游引物標(biāo)記有熒光染料。
[0028]所述熒光染料是cy3熒光染料或Cy5熒光染料。
[0029] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0030] 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒是美洲型豬藍(lán)耳病病毒。
[0031]所述美洲型豬藍(lán)耳病病毒是美洲型高致病性豬藍(lán)耳病病毒或美洲型豬藍(lán)耳病經(jīng) 典毒株。
[0032] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以有效檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒， 特異性強(qiáng)，靈敏度高，兩種病毒最低檢出濃度的數(shù)量級為102C〇PieS/μ L，耗時短，檢測快 速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況，有效防控口蹄疫（FMD)和豬藍(lán)耳病的發(fā)生，臨床應(yīng) 用前景良好。
[0033] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1寡聚核苷酸芯片探針點(diǎn)樣示意圖；
[0035]圖2定位探針和陰陽性對照探針濃度篩選芯片點(diǎn)樣示意圖；
[0036] 圖3 FMDV檢測探針濃度篩選芯片點(diǎn)樣分布圖；
[0037]圖4 Ml:分子量Marker DL1000 ;Μ2:分子量Marker DL2000 ; 1-3 :A、〇、Asial FMDV RNA擴(kuò)增產(chǎn)物；4 :PMD20-T對照；5 :PMD3D擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0038]圖5克隆基因片段的測序結(jié)果；
[0039] 圖6 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。M :100bp的分子量Marker ;1、2 :CH1_R株和 JXA1-R株RNA擴(kuò)增結(jié)果；3 :陰性對照；4、5 :質(zhì)粒PMDP和PMDHP擴(kuò)增結(jié)果；6:pMD_20T載體 對照；
[0040]圖7克隆基因片段序列；
[0041]圖8陽性對照標(biāo)記物靶基因（PC2)和探針（PC1)的結(jié)果；
[0042]圖9陽性對照標(biāo)記物（PC2)濃度和探針（PC1)濃度對雜交信號的影響；
[0043]圖1〇單重和多重RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。Μ : lOObp的分子量Marker ; 1，3, 5, 7, 9:單重 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果；2, 4, 6, 8, 10 :多重 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果；1、2 :FMDV ;7、 8:CH1-R ;9、10:JXA1-R ;
[0044]圖11多重不對稱RT-PCR標(biāo)記產(chǎn)物雜交結(jié)果。1 :FMDV ;2:CH1-R ;3 JXA1-R ; [0045]圖12 FMDV 3D片段標(biāo)記物與檢測探針在不同溫度下的雜交結(jié)果；
[0046]圖13豬藍(lán)耳病經(jīng)典株（CH1_R)標(biāo)記物在不同溫度下的雜交結(jié)果；
[0047]圖14高致病性豬藍(lán)耳病變異株（JXA1-R)標(biāo)記物在不同溫度下的雜交結(jié)果； [0048]圖15特異性檢測結(jié)果；
[0049]圖16不同稀釋度質(zhì)粒PMD3D(FMdv)的基因芯片檢測結(jié)果。1#?10#: 10X稀釋的 質(zhì)粒 PMD3D,濃度分別為 8· 34X109 ?8. 34X10°copies/u L ;
[0050]圖17不同稀釋度質(zhì)粒PMDP(PRRSV)的基因芯片檢測結(jié)果。1#?10#: 10X稀釋的 質(zhì)粒 PMDP,濃度分別為 3· 76X 109 ?3. 76X10〇copies/y L ;
[0051]圖18不同稀釋度質(zhì)粒pMDhp(HPRRSV)的基因芯片檢測結(jié)果。1#?10#:10X稀釋 的質(zhì)粒 PMDHP,濃度分別為 3. 65X109 ?3. 65X10〇copies/y L。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0053] 材料準(zhǔn)備
[0054] 1. 1 毒株
[0055] A型、0型、Asial型FMDV標(biāo)準(zhǔn)抗原：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的口蹄 疫抗體液相阻斷ELISA試劑盒；美洲型高致病性豬藍(lán)耳病病毒（HPRRSV，JXA1-R株）、美洲 型豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株（PRRSV，CH1-R株）、豬偽狂犬病毒（PRV):來自商品弱毒疫苗；豬圓 環(huán)病毒（PCV-2)、豬細(xì)小病毒（PPV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒 (BVDV) :四川農(nóng)業(yè)大學(xué)保存；20份臨床不穩(wěn)定豬群組織樣品，四川省動物疫病預(yù)防控制中 心保存。
[0056] 1. 2主要試劑
[0057] RT-PCR-步法擴(kuò)增試劑盒PrimeScript one st印 RT-PCR kit、載體pMD-20T購自 TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒TIAN pure Midi Plasmid Kit， 感受態(tài)細(xì)胞DH5a購自天根公司；RNA、DNA柱式提取試劑盒購自北京世紀(jì)元亨。
[0058] Baio@醛基載玻片、Baio@2X點(diǎn)樣緩沖液、Baio@雜交緩沖液，均購自上海百傲 科技有限公司；洗滌液1(2\55(：，0.1%508)、洗滌液11(0.2\55(：，0.1%305)、洗滌液 III (0. 2XSSC)、0. 5% NaBH40. lmol/L 磷酸鹽緩沖液等。
[0059] 1. 3主要儀器
[0060] 基因芯片點(diǎn)樣儀（Microgrid II Compact, BioRobotics，UK);基因芯片掃描儀 (GenePix Personal 4100A，Axon Instruments Inc.，USA);紫外交聯(lián)儀（CL-508,Uvitec， UK);高速冷凍離心機(jī)（Sigma，Germany);普通梯度PCR儀（BI0-RAD，USA);震蕩培養(yǎng)箱 (THZ-92C，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；核酸蛋白質(zhì)檢測儀（Ependorf Biophotometer，德 國）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。
[0061] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測方法
[0062] 1、材料和儀器
[0063]同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0064] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0065] 2· 1 PCR引物、檢測探針的設(shè)計(jì)與合成
[0066] 登錄GenBank獲取FMDV、PRRSV主要基因型（血清型）代表毒株的基因序列，利 用DNAStar軟件的MegAlign模塊分別進(jìn)行同源性分析，選取保守基因作為檢測靶區(qū)，根據(jù) 經(jīng)驗(yàn)，用01ig〇7. 0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和寡核苷酸探針。在標(biāo)記樣品時，下游引物選用5-端 Cy3修飾的引物；寡核苷酸探針5'端添加 Poly T15連接臂并氨基化。引物序列見表1，寡 核苷酸探針見表2,經(jīng)Blast比對后送上海生工合成。
[0067] 表1:引物序列和位置
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片，其特征在于：它包括 固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :5?7所示任意一個或 者任意多個基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它還包括陽性對照探針、陰性對照探 針和/或定位探針，其中，陽性對照探針是SEQ ID NO: 12所示的基因片段，陰性對照探針是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標(biāo)記了熒光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
3. -種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：它包括權(quán) 利要求1或2所述的基因芯片與擴(kuò)增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的試 齊U，其中，擴(kuò)增口蹄疫病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :1?2所示引物對；擴(kuò)增豬繁殖與呼 吸綜合征病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :3?4所示引物對。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述引物對中，SEQ ID NO :1、3所示上 游引物與SEQ ID NO :2、4所示下游引物的摩爾比為1:10。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述SEQ ID NO :2、4所示下游引物標(biāo) 記有熒光染料。 6. SEQ ID NO :5?7所示任意一個或者任意多個基因片段，與SEQ ID NO :8?10所示 任意一個或者任意多個基因片段在制備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基 因芯片中的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于：所述基因芯片還包括陽性對照探針、陰性 對照探針和/或定位探針，其中，陽性對照探針是SEQ ID NO :12所示的基因片段，陰性對照 探針是SEQ ID NO :11所示的基因片段，定位探針是標(biāo)記了熒光染料的SEQ ID NO :14所示 的基因片段。 8. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物對在制備同時擴(kuò)增口蹄疫病毒和豬 繁殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑中的用途。 9. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物對，與SEQ ID NO :5?7所示任意 一個或者任意多個基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段 在制備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒中的用途；其中，兩對引物對 為擴(kuò)增試劑，SEQ ID NO :5?10所示基因片段為檢測探針。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述引物對中，SEQ ID NO :1、3所示上 游引物與SEQ ID NO :2、4所示下游引物的摩爾比為1:10。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232790SQ201410455893
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】文心田, 李金海, 李興玉, 黃小波, 曹三杰, 文翼平, 伍銳 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)