專利名稱：一種雷公藤多苷提取物wilforol B作為KDR抑制劑的抗腫瘤血管新生用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的雷公藤多苷提取物wilforol B是一種血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體抑制劑，可以在拮抗血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體后產(chǎn)生抗腫瘤血管新生的作用。
背景技術：
血管新生是指在原有血管基礎上形成新生血管的過程，它是腫瘤生長、進展和轉(zhuǎn)移進程中必需的一個病理生理過程。大量研究表明，在腫瘤的血管生成過程中，由腫瘤細胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細胞生長因子-2 (Vascular endothelial growth factor, VEGF-2)是啟動并調(diào)控血管生成的重要介質(zhì)。大量的資料表明VEGF-2在腫瘤血管的形成中發(fā)揮中心作用。VEGF-2是內(nèi)皮細胞特異的強效有絲分裂原，并有增加血管通透性、誘導內(nèi)皮細胞遷移、成型和維持內(nèi)皮細胞的存活等功能。血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體(KDR)抑制劑，能夠有效控制VEGF-2及其受體KDR的表達對控制內(nèi)皮細胞增殖及抗血管生成具有重要的意義。目前很多公司、科研機構都開展了針對KDR激酶抑制劑的研究，對KDR的分子生物學功能的研究文獻日益增多，相關專利也不斷出現(xiàn)。1971年，F(xiàn)olkman首次提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有血管依賴性，他認為是新生血管的形成為腫瘤提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)而使其迅速生長和增殖，并提出了“抗血管生成”的假說。其中VEGF-2/KDR在腫瘤血管生成起主要作用，成為研究的主要靶點。目前已進入臨床研究的KDR激酶抑制劑有SU5416，SU11248，PTK787等。Sugen公司(現(xiàn)被Pfizer公司收購)研發(fā)的SU5416是最早進入臨床試驗的KDR激酶小分子抑制劑，是重要的KDR酪氨酸激酶抑制劑。但因在III臨床試驗中發(fā)生嚴重不良反應而終止研究。SU5416是Flk-1/KDR酪氨酸激酶的ATP競爭性抑制劑(K = 0.16 μ mol/L)，能自由通 過細胞膜，通過與ATP競爭結合定位在KDR酪氨酸激酶的腺嘌呤結合(adenine-binding pocket),抑制KDR激酶活性,從而抑制KDR的信號轉(zhuǎn)導，IC50為1.04mol/L。臨床實驗表明，SU5416對乳腺癌的增殖具有明顯的抑制作用。在體外實驗中，對腫瘤細胞的毒性作用很弱，說明了腫瘤與新生血管之間的密切關系，同時說明藥物不是直接殺死腫瘤細胞，而是通過抑制新生血管生成阻止腫瘤的惡性增殖。新一代多靶點酪氨酸激酶舒尼替尼使以KDR為靶點抗腫瘤治療有了新的進展。舒尼替尼在半抑制濃度時可抑制兩種受體酪氨酸激酶即VEGFR-2及血小板衍生生長因子受體β (H)GFR β)磷酸化，抑制效應較其他藥物強10-30倍。2006年，F(xiàn)DA批準本品用于治療胃腸道間質(zhì)瘤和晚期腎細胞癌。在乳腺癌、食管癌、胃癌等其他實體瘤的臨床研究中，也觀察到了可喜的結果?，F(xiàn)有KDR激酶小分子抑制劑較少，而其在血管生成抑制方面及通過拮抗血管生成過程來抗腫瘤方面研究結果提示通過開發(fā)KDR激酶抑制劑用于抗腫瘤血管新生越來越具有潛在價值與重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一類KDR激酶抑制劑在抗腫瘤血管新生中的應用。本發(fā)明通過從雷公藤多苷中提取分離得到wilforol B，提取分離方法為:取雷公藤多苷原料400g，經(jīng)硅膠柱層析，采用石油醚:乙酸乙酯(95: 5-60: 40)，梯度洗脫取石油醚:乙酸乙酯(80: 20)洗脫流份，甲醇重結晶，分離得到wilforol B。利用均相時間分辨熒光方法建立的高通量篩選模型對該批化合物進行體外篩選，通過功能性驗證，對wilforol B進行初步藥效學和機制研究，確定wilforol B為KDR激酶抑制劑，為抗腫瘤血管新生提供候選藥物。本發(fā)明的技術方案為:建立KDR激酶靶向抑制劑篩選模型，初篩，復篩，構效關系分析，得到具有抗腫瘤血管新生作用的候選藥物wilforol B。具體步驟如下:步驟一:KDR激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。步驟二:陽性藥驗證模型可靠性。步驟三:化合物wilforol B拮抗KDR激酶抑制曲線的繪制和IC50的測定。本發(fā)明提供上述化合物或其藥學上可接受鹽及其藥用組合物的醫(yī)療用途，尤其是在預防、延緩或治療KDR激酶參與介導的疾病，特別是抗腫瘤血管新生藥物中的用途。以上提及的wilforol B在抗腫瘤血管新生中的作用屬于本發(fā)明的保護范圍。


:圖1:KDR激酶濃度梯度優(yōu)化實驗結果。η = 3,^圖2:KDR激酶溫孵時間優(yōu)化實驗結果。=圖3:KDR激酶底物濃度優(yōu)化實驗結果。n = >，_X±S圖4:KDR激酶ATP濃度優(yōu)化實驗結果。η = 3,圖5:KDR激酶Biotin/SA信噪比優(yōu)化實驗結果。η = 3，^^圖6:陽性藥SU5416拮抗KDR激酶的抑制曲線圖。η = 3，[土S圖7:高通量篩選Z'值分布。圖8:化合物wilforol B拮抗KDR激酶的抑制曲線圖。η = 3，[土s
具體實施例方式以下結合

本發(fā)明的具體實施方式
:1.待測化合物拮抗拮抗KDR激酶活性測試I)實驗材料KDR 激酶(Invitrogen，USA)、HTRF KinEASE-TK (Cisbio，USA)、ATP、MgCl2、MnCl2、DTT(國產(chǎn))、384 低體積白板(Corning, USA)、進口槍頭(Axygen, USA)。2)實驗步驟 進行KDR激酶濃度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度、Biotin/SA信噪比優(yōu)化實驗，見圖1-5。 繪制陽性藥SU5416量效曲線并測定其IC5tl值，見圖6。 建立KDR激酶抑制劑高通量篩選模型并通過Z’值確定模型的可靠性，見圖7。.待測化合物wilforol B精確稱量，加入DMSO溶劑成母液，然后使用ES2ScreeningBuffer配 制待測化合物溶液至所需濃度，初篩濃度約為IX 10_3mol/L。 在反應容器中每孔加入KDR激酶溶液2 μ 1，底物溶液2 μ 1，緩沖液或待篩化合物4μ 1，ATP 2 μ I。反應I小時。 每孔加入TK-Ab 5 μ 1，SA-XL665 5 μ 1，室溫孵育I小時。 利用美國貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)公司檢測平臺HTRF模塊進行檢測。2.數(shù)據(jù)處理I)根據(jù)公式計算待測化合物wilforol B對KDR激酶的抑制率；2)使用抑制率和對數(shù)濃度值作圖求算IC5tl，見圖8。實驗結果KDR激酶篩選模型優(yōu)化結果:最佳KDR激酶濃度梯度為0.1ng/μ I (見圖1)，最佳溫孵時間為I小時(見圖2)，最佳底物濃度為94.90ηΜ(見圖3)，最佳ATP濃度為
0.75 μ M(見圖4)，最佳Biotin/SA信噪比為4/1 (見圖5)。用陽性藥SU5416驗證模型，測得IC5tl為1028nM(見圖6)，并通過V值確定模型的可靠性(見圖7)。化合物wilforol B結構式與IC5tl如下:
權利要求
1.式化合物或其藥學上可以接受的鹽:
2.權利要求1要求保護的式(I)的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體抑制劑抗腫瘤血管新生的用途。
3.按照權利要求2的用途，作為血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體抑制劑，抑制腫瘤血管新生。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體抑制劑或其藥學上可接受的鹽。此化合物為雷公藤多苷提取物wilfbrol B，可以抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體的活性，有效地產(chǎn)生抗腫瘤血管新生的作用。此化合物具有很強的體外拮抗血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體激酶的作用，可以有效的抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子-2受體的作用，拮抗腫瘤血管新生過程。
文檔編號A61P35/00GK103087141SQ20121054376
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權日2012年12月12日
發(fā)明者嚴明, 汪豪, 江振洲, 張陸勇, 吉金子 申請人:中國藥科大學