本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用及其篩選方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來(lái)，在臨床和基礎(chǔ)研究中，小分子化合物被廣泛作為藥物或調(diào)控分子，用于治療疾病或研究生物系統(tǒng)。這些小分子化合物，可以以共價(jià)或非共價(jià)的方式與靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)合。但是，由于早期的研究人員擔(dān)心共價(jià)化合物會(huì)有較大的脫靶("off-target")效應(yīng)，造成很大的副作用，因此在過(guò)去的合理藥物篩選和設(shè)計(jì)中，共價(jià)化合物通常被避免。也正因?yàn)槿绱?，過(guò)去的計(jì)算機(jī)輔助篩選方法，基本上都針對(duì)非共價(jià)化合物的對(duì)接(docking)進(jìn)行優(yōu)化，用于篩選、設(shè)計(jì)、優(yōu)化和評(píng)價(jià)非共價(jià)化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合。然而，近幾年的總結(jié)研究發(fā)現(xiàn)，在臨床上使用的小分子化合物藥物中，有近1/3的藥物是共價(jià)化合物，即通過(guò)共價(jià)機(jī)制(中間態(tài)或最終形式)，與靶標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)合。這類(lèi)共價(jià)化合物藥物包括阿司匹林、盤(pán)尼西林、磷霉素等。因此，近幾年來(lái)，很多計(jì)算軟件和方法進(jìn)行了改善，以用于針對(duì)蛋白靶標(biāo)的共價(jià)化合物(藥物或調(diào)控分子)的篩選和優(yōu)化，例如DOCKovalent,CovalentDock,CovDock,DOCKTITE等。但是，這些方法都涉及到很復(fù)雜的共價(jià)鍵形成的計(jì)算，而且預(yù)測(cè)結(jié)果也并不太理想。其中，DOCKovalent是目前唯一一個(gè)成功指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)篩選得了到共價(jià)抑制劑的計(jì)算方法。

多胺(polyamines)是一類(lèi)從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽(yáng)離子小分子，在所有生物體中都存在，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活及正常生物學(xué)功能等都不可缺少。多胺帶多正電荷的特性，使它們能通過(guò)與帶負(fù)電荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等)形成靜電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學(xué)過(guò)程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由基清除等。天然的多胺有很多種。在哺乳動(dòng)物中，天然存在的有三種，即putrescine(腐胺)，spermidine(精脒)，spermine.(精胺)，它們對(duì)哺乳動(dòng)物正常生長(zhǎng)和發(fā)育必不可少。由于多胺具有重要的生物學(xué)功能，其細(xì)胞內(nèi)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控。在快速繁殖的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)中，多胺水平也會(huì)上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細(xì)胞增殖加快、凋亡減少、以及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物研發(fā)中的一個(gè)重要手段。

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)是多胺體內(nèi)合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)于精胺和精脒的合成至關(guān)重要，因?yàn)榫泛途叩陌北鶃?lái)源于AdoMetDC的脫羧反應(yīng)。因此，合成AdoMetDC抑制劑，抑制精胺和精脒的生成，是目前很受關(guān)注的一個(gè)腫瘤治療途徑。同時(shí)，由于病原微生物也需要維持正常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制劑也成為針對(duì)病原微生物的一個(gè)重要藥物靶標(biāo)。

當(dāng)前，AdoMetDC的抑制劑MGBG(米托胍腙)已經(jīng)被用于臨床中的抗白血病治療和癌癥的化療輔助藥物。但MGBG會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體損傷，因此毒副作用非常大。AdoMetDC的抑制劑CGP 48664(SAM486A)已經(jīng)進(jìn)入I期和II期臨床評(píng)估。因此，開(kāi)發(fā)出具有更好效果的AdoMetDC新型抑制劑具有重要意義和價(jià)值。

在我們的前期研究中(Scientific Reports,2015,vol.5:10754)，我們提出了一個(gè)S-腺苷甲硫氨酸AdoMetDC的非共價(jià)抑制劑的篩選策略。通過(guò)將活性AdoMetDC(腺苷甲硫氨酸脫羧酶)的一個(gè)底物結(jié)合口袋的關(guān)鍵非天然氨基酸Pyruvate68，突變?yōu)镾er(絲氨酸)，我們驗(yàn)證可以預(yù)測(cè)非共價(jià)抑制劑的結(jié)合構(gòu)象，并用于非共價(jià)抑制劑的篩選。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，共價(jià)抑制劑的結(jié)合構(gòu)象，也可以比較好的得到預(yù)測(cè)，但是由于小分子共價(jià)基團(tuán)與Ser68間存在空間碰撞，所以共價(jià)基團(tuán)會(huì)有較大的偏差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用及其篩選方法。

本發(fā)明技術(shù)方案為：

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

其中R₁為苯基或苯胺或苯甲酰胺或烴基基團(tuán)或呋喃或吡咯或吡啶及其取代基團(tuán)；該抑制劑還包括含有通式I所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步優(yōu)選該小分子共價(jià)抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

該小分子商品標(biāo)號(hào)為：MCULE-3265041117(http://zinc.docking.org/substance/41347)

一種篩選S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的小分子共價(jià)抑制劑的方法，所述方法包括以下步驟：

1)以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶晶體結(jié)構(gòu)中的丙酮酰68殘基刪除，并在Rosetta軟件中優(yōu)化，得到優(yōu)化后的蛋白晶體結(jié)構(gòu)；

2)搜索用于對(duì)接的小分子，小分子化合物庫(kù)來(lái)自ZINC對(duì)接數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索小分子，服務(wù)器返回搜索結(jié)果后，得到對(duì)應(yīng)的小分子結(jié)構(gòu)；

3)將所述步驟1)優(yōu)化后的蛋白晶體結(jié)構(gòu)和步驟2)搜索得到的小分子結(jié)構(gòu)利用AutoDockVina軟件進(jìn)行對(duì)接計(jì)算，得到對(duì)接計(jì)算結(jié)果；

4)對(duì)步驟3)得到的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行篩選，根據(jù)打分排序，篩選得到小分子共價(jià)抑制劑；

完成所述方法在篩選S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的共價(jià)抑制劑上的應(yīng)用。

所述步驟2)搜索小分子條件為：①SMILES表達(dá)式：C(＝O)NN，并選擇“substructure”子結(jié)構(gòu)，以搜索含有上述基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)；②分子量大于200且小于400；③脂水分配系數(shù)≤3.5；④可旋轉(zhuǎn)鍵大于等于3，且小于等于9；⑤氫鍵供體大于等于2，且小于等于10；⑥氫鍵受體大于等于2，且小于等于10。

所述步驟4)篩選條件包括：①SMILES表達(dá)式中共價(jià)結(jié)合原子即NH₂中的N的位置，與原晶體結(jié)構(gòu)中Pyr68的共價(jià)O原子或抑制劑共價(jià)結(jié)合后的共價(jià)N原子位置的距離小于1埃；②該構(gòu)象的對(duì)接打分小于等于-8.0。

所述方法還包括光譜法和高效液相色譜方法檢測(cè)小分子對(duì)S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制作用、驗(yàn)證小分子共價(jià)抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是否是共價(jià)結(jié)合的。

所述光譜法為小分子與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶混合后在37℃共孵育30min后，添加底物甲硫氨酸反應(yīng)5min后進(jìn)行檢測(cè)，DMSO為溶劑對(duì)照，S-腺苷甲硫氨酸抑制劑米托胍腙為陽(yáng)性對(duì)照。

所述高效液相色譜方法所用儀器為Waters e2695，柱子為Waters C18反相柱，所述反向柱為5um，4.6x250mm，柱溫30℃，流動(dòng)相0.01mol/L甲酸銨：甲醇＝97：3，所述0.01mol/L甲酸銨pH為3.5，流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；上樣前，加入反應(yīng)體系9倍體積的甲醇終止反應(yīng)，12000g離心10min除去變性的蛋白后，取上清樣品進(jìn)行分析，通過(guò)檢測(cè)底物甲硫氨酸的消耗，驗(yàn)證小分子對(duì)S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制作用。

所述驗(yàn)證小分子共價(jià)抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是否是共價(jià)結(jié)合的具體方法為，將小分子共價(jià)抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶孵育不同時(shí)間后添加底物甲硫氨酸啟動(dòng)催化反應(yīng)，10min后終止反應(yīng)檢測(cè)底物的消耗，所述孵育不同時(shí)間為0min，30min，60min，90min。

所述的方法中所用的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于：以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的第68位丙酮?；鶆h除后，與底物甲硫氨酸結(jié)合口袋形成擴(kuò)大的結(jié)合口袋為S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物篩選和設(shè)計(jì)口袋。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明篩選的共價(jià)抑制劑對(duì)S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶作用明顯；

2、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，不需要對(duì)已有小分子對(duì)接算法進(jìn)行復(fù)雜修改，且效果良好，該方法適用于快速進(jìn)行共價(jià)抑制劑的篩選與設(shè)計(jì)；

3、本發(fā)明方法與其他預(yù)測(cè)方法比，具有相當(dāng)或更好的預(yù)測(cè)效果。

4、本發(fā)明的計(jì)算篩選方法，由于不需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系的不同而修改對(duì)接算法，所以與其它已知共價(jià)抑制劑篩選方法相比，具有更廣泛的適用性，可以適用于所有共價(jià)抑制劑的篩選和設(shè)計(jì)體系；可以廣泛利用已經(jīng)發(fā)展完善的眾多非共價(jià)抑制劑的對(duì)接計(jì)算方法，因此可以大大加速共價(jià)抑制劑的篩選、優(yōu)化和發(fā)現(xiàn)。

5、本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是人源AdoMetDC，但是由于不同來(lái)源的AdoMetDC之間具有同源性，因此我們的抑制劑通用能夠作用于其它非人源的AdoMetDC，以及其它的AdoMetDC的同源蛋白酶。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑對(duì)AdoMetDC的活性抑制作用對(duì)比效果。

圖2：HPLC分析結(jié)果驗(yàn)證本發(fā)明小分子對(duì)AdoMetDC的抑制作用；

圖3：本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑與AdoMetDC共孵育不同時(shí)間對(duì)抑制能力的影響；

圖4：本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑分子結(jié)構(gòu)；

圖5：本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑與AdoMetDC的對(duì)接構(gòu)象

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

實(shí)施例1

1)以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將PDB ID為3DZ5的AdoMetDC晶體結(jié)構(gòu)中的Pyr68殘基刪除，并在Rosetta中優(yōu)化，得到優(yōu)化后的SCAR蛋白晶體結(jié)構(gòu)；

2)用于對(duì)接的小分子化合物庫(kù)，來(lái)自與ZINC(http://zinc.docking.org)對(duì)接數(shù)據(jù)庫(kù)，小分子搜索條件為：①SMILES表達(dá)式：CONN，并選擇“substructure”子結(jié)構(gòu)，以搜索含有上述基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)；②分子量大于200且小于400；③xLogP≤3.5；④可旋轉(zhuǎn)鍵大于等于3，且小于等于9；⑤氫鍵供體大于等于2，且小于等于10；⑥氫鍵受體大于等于2，且小于等于10，服務(wù)器返回搜索結(jié)果后，得到對(duì)應(yīng)的小分子的結(jié)構(gòu)；

3)將所述步驟1)優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)和步驟2)搜索到小分子結(jié)構(gòu)利用AutoDockVina進(jìn)行對(duì)接計(jì)算，得到對(duì)接計(jì)算結(jié)果；

4)對(duì)步驟3)得到的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行篩選，篩選條件包括：①SMILES表達(dá)式中共價(jià)結(jié)合原子(NH₂中的N)的位置，與原晶體結(jié)構(gòu)中Pyr68的共價(jià)O原子(或抑制劑共價(jià)結(jié)合后的共價(jià)N原子)位置的距離小于1埃；①該構(gòu)象的對(duì)接打分小于等于-8.0，根據(jù)打分排序，選擇可購(gòu)買(mǎi)化合物用于實(shí)驗(yàn)篩選，得到小分子共價(jià)抑制劑MCULE-3265041117，該小分子共價(jià)抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例2

利用專(zhuān)利(ZL201410530672.3)的方法，我們進(jìn)行了AdoMetDC活性評(píng)價(jià)，光譜法檢測(cè)所述步驟4)得到的實(shí)施例1小分子共價(jià)抑制劑對(duì)AdoMetDC的活性抑制作用，小分子與AdoMetDC混合后在37度共孵育30min后，添加底物反應(yīng)5min后進(jìn)行檢測(cè)，DMSO為溶劑對(duì)照，AdoMetDC抑制劑MGBG(米托胍腙)為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1，這個(gè)小分子共價(jià)抑制劑都比MGBG有更好的抑制能力；

實(shí)施例3

利用高效液相色譜(HPLC)方法，通過(guò)檢測(cè)底物AdoMet的消耗，驗(yàn)證實(shí)施例1小分子對(duì)AdoMetDC的抑制作用。HPLC所用儀器為Waters e2695，柱子為Waters C18反相柱(5um，4.6x250mm)，柱溫30度，流動(dòng)相0.01mol/L甲酸銨(pH 3.5)：甲醇＝97：3，流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。上樣前，加入9倍體積的甲醇終止反應(yīng)，12000g離心10min除去變性的蛋白后，取上清樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可知小分子與AdoMetDC在37度混合孵育30min后，添加底物反應(yīng)0min、5min或10min后終止反應(yīng)，并檢測(cè)底物的消耗。圖2顯示，這個(gè)小分子共價(jià)抑制劑都能夠抑制底物的消耗(主峰越高，表示檢測(cè)體系中底物量越多)；

實(shí)施例4

利用HPLC方法，驗(yàn)證實(shí)施例1小分子共價(jià)抑制劑都是與AdoMetDC共價(jià)結(jié)合的，將小分子共價(jià)抑制劑與AdoMetDC孵育不同的時(shí)間(0min，30min，60min，90min)后添加底物AdoMet啟動(dòng)催化反應(yīng)，10min后終止反應(yīng)檢測(cè)底物的消耗。結(jié)果顯示(圖3)隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，小分子具有更高的抑制能力，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，AdoMetDC的活性(空心圓)沒(méi)有顯著變化，非共價(jià)抑制劑MGBG(空心方塊)的抑制能力也沒(méi)有增加。而我們發(fā)現(xiàn)的3個(gè)小分子抑制劑，與AdoMetDC孵育時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越好(底物殘余百分比越大)。底物殘余百分比是指所述樣品的底物峰面積與單獨(dú)的底物對(duì)照樣品的峰面積的比值。該比值越大，表明底物殘余量越多，酶催化反應(yīng)消耗的底物越少，即表觀酶活性越弱。

本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。-C(＝O)-NH-N*H2為共價(jià)基團(tuán)，N*為共價(jià)結(jié)合原子。本發(fā)明小分子共價(jià)抑制劑與AdoMetDC的對(duì)接構(gòu)象見(jiàn)圖5，其中M8M為PDB結(jié)構(gòu)3DZ5中的AdoMetDC共價(jià)抑制劑。這個(gè)小分子的共價(jià)結(jié)合原子N*均位于共價(jià)抑制劑M8M的共價(jià)N原子位置(球狀點(diǎn)顯示其原子半徑)，因此能夠與Pyr68的O原子形成共價(jià)鍵。周?chē)年P(guān)鍵相互作用殘基在M8M對(duì)應(yīng)圖中進(jìn)行了標(biāo)明。

實(shí)施例5

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例6

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例7

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例8

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例9

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例10

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例11

一種小分子共價(jià)抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應(yīng)用，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

上述的實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，而不應(yīng)視為對(duì)于本發(fā)明的限制，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求記載的技術(shù)方案，包括權(quán)利要求記載的技術(shù)方案中技術(shù)特征的等同替換方案為保護(hù)范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進(jìn)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。