本發(fā)明涉及一種化妝品組合物，該化妝品組合物中，將對利用銀耳菌絲體使松蘿發(fā)酵的發(fā)酵物進(jìn)行提取(extraction)而得的、銀耳菌絲體的松蘿發(fā)酵提取物作為有效成分，因而可具有改善皺紋、改善皮膚彈性的效果。
背景技術(shù)：
：皮膚老化緣于自由基對生物體的氧化性損傷。在生物體內(nèi)，氧化劑或自由基的攻擊和抗氧化劑的防御形成密切的協(xié)調(diào)。但是，由于抗氧化劑的防御并不是完美無缺，因此使作為生物體組成分子的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物體分子持續(xù)受到氧化劑或自由基的氧化性損傷，并且其氧化反應(yīng)產(chǎn)物會隨著年齡的增加而蓄積。尤其，因?yàn)槠つw始終與氧相接觸，受到暴露于紫外線等的氧化負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致基于酶或非酶的抗氧化防御膜破損，引起生物體組成成分的損傷，結(jié)果帶來皮膚彈性下降、色素沉積、形成皺紋等形態(tài)的皮膚老化。所述生物體組成成分的損傷，例如是脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、作為彈性纖維的骨膠原和彈性蛋白的鏈斷裂及非正常交叉結(jié)合、透明質(zhì)酸鏈斷裂、黑色素形成反應(yīng)的促進(jìn)，脫氧核糖核酸(DNA)氧化等。尤其，蛋白質(zhì)的氧化會使骨膠原(collagen)、透明質(zhì)酸(hyaluronicacid)、彈性蛋白(elastin)、蛋白多糖(proteoglycan)、纖連蛋白(fibronectin)等皮膚結(jié)合組織發(fā)生斷裂并造成嚴(yán)重的多炎癥反應(yīng)以及阻礙皮膚彈性，如果變得更嚴(yán)重，則脫氧核糖核酸發(fā)生變異而導(dǎo)致基因突變、誘發(fā)癌癥、免疫力下降。為防止這種皮膚老化并提高皮膚彈性，人們使用抗氧化劑、保濕或改善皺紋的化妝品。但是，迄今為止的化妝品僅停留在預(yù)防皮膚老化的層面，很難獲得實(shí)質(zhì)性的提高彈性的效果。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：韓國公開專利第2011-0067994號：含有松蘿提取物的皮膚外用劑組合物專利文獻(xiàn)2：韓國公開專利第2007-0055372號：番石榴發(fā)酵組合物及其用途專利文獻(xiàn)3：韓國公開專利第2012-0087408號：具有抗氧化活性的銀耳發(fā)酵提取物及含有其的化妝品組合物技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：對此，在本發(fā)明人為開發(fā)將天然提取物作為有效成分并具有改善皮膚皺紋及彈性的效果的化妝品組合物而從多方面進(jìn)行努力的結(jié)果，確認(rèn)到利用銀耳菌絲體使松蘿發(fā)酵，不僅明顯降低松蘿提取物所具有的細(xì)胞毒性，并且還能夠發(fā)揮松蘿提取物未曾具有的、優(yōu)異的骨膠原及彈性蛋白合成功能，從而顯現(xiàn)出對皮膚皺紋以及彈性的改善功效，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種化妝品組合物及其制備方法，將利用銀耳菌絲體使松蘿發(fā)酵的發(fā)酵物進(jìn)行提取而得的提取物作為有效成分。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種化妝品組合物，該化妝品組合物中，將對利用銀耳菌絲體使松蘿發(fā)酵獲得的發(fā)酵物進(jìn)行提取而得的、銀耳菌絲體的松蘿發(fā)酵提取物作為有效成分。并且，本發(fā)明提供松蘿銀耳發(fā)酵提取物的制備方法，該制備方法包括：對松蘿進(jìn)行滅菌的步驟；使經(jīng)過滅菌的上述松蘿在培養(yǎng)基濕潤的步驟；向經(jīng)過濕潤的上述松蘿接種銀耳菌絲體后進(jìn)行發(fā)酵來獲取發(fā)酵物的步驟；以及使用提取溶劑對上述發(fā)酵物進(jìn)行提取的步驟。根據(jù)本發(fā)明，通過利用銀耳菌絲體的發(fā)酵，來明顯降低松蘿提取物所具有的細(xì)胞毒性，因而對皮膚安全，并且，由于具有松蘿提取物未曾具有的、優(yōu)異的骨膠原及彈性蛋白合成功能，因而在用于改善皮膚皺紋及皮膚彈性的化妝品組合物方面有利。附圖說明圖1為示出對實(shí)施例1至實(shí)施例4中的提取物及比較例1中的提取物測定骨膠原合成功能的測定結(jié)果的圖表。圖2為示出對實(shí)施例2中的提取物及比較例1中的提取物測定細(xì)胞生存能力的測定結(jié)果的圖表。圖3為示出對實(shí)施例2中的提取物及比較例1中的提取物測定彈性蛋白合成功能的測定結(jié)果的圖表。圖4為示出在涂抹分別含有實(shí)施例2中的提取物及比較例1中的提取物的實(shí)驗(yàn)劑型面霜及比較劑型面霜后測定皮膚彈性改善程度的測定結(jié)果的圖表。具體實(shí)施方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。本發(fā)明公開具有改善皺紋及彈性的效果的、將松蘿銀耳發(fā)酵提取物作為有效成分的化妝品組合物，上述化妝品組合物將松蘿作為原料，通過利用銀耳菌絲體進(jìn)行的發(fā)酵，明顯降低松蘿提取物所具有的細(xì)胞毒性，使改善皮膚皺紋及彈性的效果最大化。松蘿(Usnealongissima)是呈黃色或綠色的灌木狀地衣類植物，具有長莖和纏繞在一起的線團(tuán)般的圓盤形狀附著器。中醫(yī)中用于利尿劑、解熱劑、祛痰劑。生長區(qū)域分布在溫帶地區(qū)的高山至寒帶，分布在韓國、日本等地。這種松蘿提取物以抑制黑色素的生成、增加透明質(zhì)酸來具有美白皮膚、防止皮膚老化的效果而聞名。本發(fā)明利用銀耳菌絲體使松蘿發(fā)酵。銀耳是擔(dān)子菌類非褶菌目銀耳科的蘑菇，生長在韓國、日本、歐洲、北美洲、澳大利亞等地，主要生長在針葉樹的樁子或枯木周邊。其直徑為10～30cm，子實(shí)體高為10～25cm，肉質(zhì)，底部粗壯的柄上發(fā)出許多分枝，枝端形成無數(shù)曲折的瓣片，形似巨大的繡球。因100g的銀耳中含有43.6g的β-葡聚糖而具有出色的抗癌效果，此外還以降血壓或?qū)⒀腔謴?fù)正常并具有造血功能而聞名。具體地，本發(fā)明的松蘿銀耳發(fā)酵提取物的制備方法包括：對松蘿進(jìn)行滅菌的步驟；使經(jīng)過滅菌的上述松蘿在培養(yǎng)基濕潤的步驟；向經(jīng)過濕潤的上述松蘿接種銀耳菌絲體后進(jìn)行發(fā)酵來取得發(fā)酵物的步驟；以及使用提取溶劑對上述發(fā)酵物進(jìn)行提取的步驟。以下，對各步驟進(jìn)行詳細(xì)的說明。首先，對松蘿進(jìn)行滅菌。滅菌是利用高壓蒸氣滅菌器(autoclave)對松蘿中存在的所有菌株進(jìn)行滅菌，在業(yè)界常規(guī)條件下進(jìn)行。作為一例，通過在100℃至125℃的溫度下進(jìn)行5分鐘至30分鐘的熱處理來實(shí)施對松蘿進(jìn)行滅菌的步驟。接著，使經(jīng)過滅菌的上述松蘿在培養(yǎng)基濕潤。通過使松蘿在培養(yǎng)基中濕潤，在之后的利用銀耳菌絲體進(jìn)行發(fā)酵時，供給菌絲體的碳源、能源，從而更加有效地進(jìn)行發(fā)酵。上述培養(yǎng)基可選自由馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar)、馬鈴薯葡萄糖肉湯(potatodextrosebroth)、沙氏葡萄糖肉湯(sabourauddextrosebroth)及它們的混合物組成的組中的一種。相對于培養(yǎng)基重量，向上述培養(yǎng)基添加的松蘿的含量為1.0重量％至30重量％。接著，向經(jīng)過濕潤的上述松蘿接種銀耳菌絲體后進(jìn)行發(fā)酵來獲得發(fā)酵物。此時，發(fā)酵可在適宜的菌絲體生長環(huán)境下實(shí)施。優(yōu)選地，在20～30℃的溫度下實(shí)施發(fā)酵，更為優(yōu)選地，在25～30℃的溫度下通過10天至30天的靜置培養(yǎng)實(shí)施發(fā)酵。若發(fā)酵溫度小于20℃，則菌絲體不容易生長，若發(fā)酵溫度大于30℃，則菌絲體的生長過快，有可能對提取物的性能有所影響。最后，使用提取溶劑對上述發(fā)酵物進(jìn)行提取。可使用的提取溶劑為選自由水、碳數(shù)1至6的多元醇、碳數(shù)1至4的低級醇、乙酸乙酯、甘油及它們的混合溶劑組成的組中的1種，優(yōu)選地，使用70％乙醇，添加達(dá)到原料重量的2～50倍(體積)的提取溶劑。上述提取可使用熱水提取、常溫提取、高壓提取、加溫提取、超聲波提取或超臨界提取等常規(guī)方法。提取溫度可以由技術(shù)人員根據(jù)提取方法采用適當(dāng)、多樣的溫度范圍，例如，可在20℃至100℃的溫度下進(jìn)行提取，但并不局限于此。并且，提取時間根據(jù)提取方法而不同，技術(shù)人員可采用適當(dāng)?shù)奶崛r間，但并不局限于此，可在約1小時至數(shù)日的范圍內(nèi)實(shí)施單次或數(shù)次提取。對于上述利用第1次提取溶劑進(jìn)行提取并獲得的提取物，可以使用常規(guī)方法進(jìn)行過濾而獲得去掉雜質(zhì)的液狀提取物，或可使用常規(guī)方法對所得的液狀提取物進(jìn)行減壓濃縮和/或干燥而獲得粉末形態(tài)的提取物。相對于組合物總重量，含有0.0001重量％至90重量％的本發(fā)明的上述提取物，優(yōu)選含有0.001重量％至30.0重量％的本發(fā)明的上述提取物。為實(shí)現(xiàn)最低程度的改善皮膚彈性及皺紋的效果，優(yōu)選提取物的含量為上述最小值以上，考慮到因大量添加而導(dǎo)致的使用感下降及對各種劑型的適用可能性，優(yōu)選提取物的含量為上述最大值以下。此時，優(yōu)選根據(jù)劑型中含有的成分含量來在上述范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)節(jié)提取物的含量。并且，在將本發(fā)明的提取物用作組成成分時，能夠以冷凍干燥的粉末狀態(tài)進(jìn)行使用，不僅如此，還能夠以分散或溶解在水或常規(guī)有機(jī)溶劑中的液體狀態(tài)進(jìn)行使用。并且，優(yōu)選在本發(fā)明化妝品組合物中，在不損傷本發(fā)明主要效果的前提下，除上述提取物成分以外，可添加對主要效果起提升作用的其他成分。本發(fā)明的化妝品組合物所包含的成分除上述有效成分以外，還可包含通常用于化妝品組合物的成分，例如，可包含穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等常規(guī)助劑和載體。本發(fā)明的化妝品組合物可制備成本領(lǐng)域中通常使用的任何劑型，具體可制備成溶液、懸浮液、乳濁液、膠、乳液、精華素、面霜、粉餅、香皂、面膜、洗面奶、油、粉底、噴射劑等化妝品劑型。在本發(fā)明的劑型為溶液或乳濁液的情況下，作為載體成分可使用溶劑、增溶劑或乳濁化劑，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇的脂肪酸酯。在本發(fā)明的劑型為懸浮液的情況下，作為載體成分可使用如水、乙醇或丙二醇等液狀稀釋劑、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等的懸浮劑、羥基氧化鋁、微晶纖維素、膨潤土、瓊脂或黃蓍樹膠等。在本發(fā)明的劑型為面霜或膠的情況下，作為載體成分可使用蠟、石蠟、黃蓍樹膠、動物性油、淀粉、纖維素衍生物、硅酮、膨潤土、聚乙二醇、二氧化硅、氧化鋅或滑石粉等。在本發(fā)明的劑型為粉餅或噴射劑的情況下，作為載體成分可包含如二氧化硅、滑石粉、氫氧化鋁、乳糖、硅酸鈣、氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚等促進(jìn)劑。在本發(fā)明的劑型為含表面活性劑的洗面奶的情況下，作為載體成分可使用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、咪唑啉鎓衍生物、羥乙基磺酸鹽、甲基牛磺酸鹽、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、脂肪族醇、烷基酰胺甜菜堿、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。以下，為了有助于理解本發(fā)明而公開優(yōu)選實(shí)施例。但是，以下實(shí)施例僅用于更加容易地理解本發(fā)明，本發(fā)明的內(nèi)容并不限制于實(shí)施例。實(shí)施例1至實(shí)施例4：制備利用銀耳菌絲的松蘿發(fā)酵提取物在向沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(sabourauddextrosebroth)中添加經(jīng)滅菌的松蘿8wt％后濕潤。之后，相對于濕潤的松蘿，接種30wt％的經(jīng)培養(yǎng)的銀耳菌絲，在30℃的溫度下分別靜置培養(yǎng)5天、10天、20天、30天。將100g的所獲得的發(fā)酵物放入重量比達(dá)20倍的70％乙醇并在25℃的溫度下提取4個小時后過濾，除去菌體等不溶性物質(zhì)，利用旋轉(zhuǎn)減壓濃縮機(jī)除去了溶劑。所獲得的松蘿發(fā)酵提取物的收率如下表1。表1區(qū)分實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4發(fā)酵時間(day)5102030收率(％)3.223.141.113.42比較例1：松蘿提取物粉碎200g的松蘿并放入重量比達(dá)20倍的70％乙醇中，在25℃的溫度下提取4個小時后過濾，除去菌體等不溶性物質(zhì)，利用旋轉(zhuǎn)減壓濃縮機(jī)除去了溶劑，獲得了松蘿提取物。實(shí)驗(yàn)例1：按發(fā)酵時間比較松蘿發(fā)酵提取物的骨膠原合成功能按每孔形成1×106細(xì)胞，在48孔微型板接種作為人體正常上皮細(xì)胞的纖維芽細(xì)胞，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。以100μg/ml添加陽性對照組及實(shí)施例1至實(shí)施例4、比較例的提取物，補(bǔ)充培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，利用骨膠原試劑盒(寶生物工程，Takara，日本)對各孔的上層液測定IC型前膠原(procollagen)鈦(PIP)的量，測定了由此合成的骨膠原的量。圖1及表2示出其結(jié)果。表2區(qū)分PIP-1生成量(％)對照組100陽性對照組(EGF)116.3實(shí)施例181.7實(shí)施例2146.6實(shí)施例3125.7實(shí)施例4138.7比較例188.1參照圖1及表2的結(jié)果，相對于陽性對照組，本發(fā)明的松蘿發(fā)酵提取物呈現(xiàn)出優(yōu)異的骨膠原合成功能。尤其，發(fā)酵10天的實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物呈現(xiàn)出最優(yōu)異的效果。這可以認(rèn)為通過利用銀耳菌絲的發(fā)酵過程，轉(zhuǎn)換為可呈現(xiàn)出未曾在松蘿提取物中確認(rèn)到的骨膠原合成功能的有效成分。實(shí)驗(yàn)例2：確認(rèn)通過發(fā)酵減少毒性為了比較在上述實(shí)施例2及比較例1中獲得的樣本的細(xì)胞生存力，應(yīng)用以下文獻(xiàn)中的MTTassay方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)(HanHK、ChoiSS、ShinJC＜ChungHS(2007)Astudyonsingleoraldosetoxicityofhighlydevelopedanthocyanin-pigmentedricevarieties.J.Kor.Soc.FoodSci.Nutr.36：527-533)。對照組(control)是未處理組，以對照組的細(xì)胞生存率作為100％，來示出了結(jié)果。圖2表示在多種濃度(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)條件下確認(rèn)到的比較例1及實(shí)施例2的細(xì)胞生存率結(jié)果。如圖2表示，以200μg/ml濃度處理時，實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物呈現(xiàn)出了約80％的細(xì)胞生存率，相反，在比較例1的松蘿提取物中確認(rèn)到約10％左右的細(xì)胞生存率。由此可以確認(rèn)，通過發(fā)酵，松蘿提取物的細(xì)胞毒性減少約2倍，由此，上述松蘿發(fā)酵提取物可以作為對皮膚安全的有效成分來用于化妝品。實(shí)驗(yàn)例3：確認(rèn)松蘿提取物和松蘿發(fā)酵提取物的彈性蛋白合成功能將纖維芽細(xì)胞(CCD-986Sk)利用添加有10％FBS的IMDM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為5×105cell/well后，接種到12孔板培養(yǎng)了18個小時。培養(yǎng)后，以100μg/ml濃度對上述實(shí)施例2及比較例1的樣本進(jìn)行處理并培養(yǎng)了24個小時。從所培養(yǎng)的細(xì)胞中提取核糖核酸(RNA)并通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR，Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)確認(rèn)了彈性蛋白原(tropoelastin)的表達(dá)增量。圖3表示了其結(jié)果。參照圖3，可知通過發(fā)酵可增強(qiáng)彈性蛋白合成功能。實(shí)驗(yàn)例4：確認(rèn)皮膚彈性度的改善根據(jù)表3，通過常規(guī)方法制備含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的面霜，并確認(rèn)了彈性改善度。表3利用上述比較劑型及實(shí)驗(yàn)劑型，對年齡在30歲至40歲之間的10名女性作為實(shí)驗(yàn)對象，按一天兩次在皮膚上持續(xù)涂抹，兩周后，利用cutometerMPA280設(shè)備確認(rèn)了皮膚彈性。根據(jù)數(shù)學(xué)式1計算其改善率并在圖4中進(jìn)行示出。如圖4表示，確認(rèn)到通過發(fā)酵可以增強(qiáng)皮膚彈性改善率。數(shù)學(xué)式1彈性改善率(％)＝(劑型使用組彈性一對照組彈性)×100/對照組彈性以下，以本發(fā)明的劑型例說明柔膚化妝水、收斂化妝水、營養(yǎng)化妝水、營養(yǎng)面霜、按摩面霜、精華素及面膜，但本發(fā)明的組合物劑型并不局限于此。劑型例1：柔膚化妝水(化妝水)根據(jù)表4，以常規(guī)方法制備了含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的柔膚化妝水。表4成分含量(％)實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物1甘油51，3-丁二醇3甜菜堿1尿囊素0.1DL-泛醇0.3EDTA-2Na0.02透明質(zhì)酸鈉粉0.05乙醇5辛基十二醇聚醚-160.2聚氧乙烯硬化蓖麻油0.2香料適量防腐劑適量色素適量純凈水余量合計100劑型例2：營養(yǎng)化妝水(乳液(lotion))根據(jù)表5，通過常規(guī)方法制備了含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的營養(yǎng)化妝水。表5成分含量(％)實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物3甘油硬脂酸酯SE1.5鯨蠟硬脂醇1.0牛油樹脂1.5聚山梨醇酯601.3去水山梨糖醇單硬脂酸酯0.5硬化食物油1礦物油5角鯊?fù)?環(huán)甲硅酮2二甲基硅酮0.8生育酚醋酸酯0.5卡波姆0.12甘油51，3-丁二醇3透明質(zhì)酸鈉粉0.05三乙醇胺0.12香料適量防腐劑適量色素適量蒸餾水余量合計100劑型例3：按摩霜根據(jù)表6，通過常規(guī)方法制備了含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的按摩霜。表6成分含量(％)實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物3親油性一硬脂酸甘油酯1.5鯨蠟硬脂醇1.5硬脂酸1聚山梨醇酯601.5去水山梨糖醇硬脂酸酯0.6異硬脂酸異硬脂醇酯5角鯊?fù)?礦物油35二甲基硅酮0.5羥乙基纖維素0.12甘油61，3-丁二醇3三乙醇胺0.3香料適量防腐劑適量色素適量蒸餾水余量合計100劑型例4：精華素根據(jù)表7，通過常規(guī)方法制備了含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的精華素。表7成分含量(重量％)實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物3甘油6甜菜堿5PEG15002尿囊素0.1DL-泛醇0.3EDTA-2Na0.02氫化卵磷脂0.6羥乙基纖維素0.1透明質(zhì)酸鈉粉0.08羧基乙烯基聚合物0.2三乙醇胺0.2神經(jīng)酰胺0.2辛基十二醇3角鯊?fù)?聚山梨醇酯600.4甘油硬脂酸酯SE1.5香料適量防腐劑適量色素適量蒸餾水余量合計100劑型例5：面膜根據(jù)下表8，通過常規(guī)方法制備了含有實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物的面膜。表8成分含量(重量％)實(shí)施例2的松蘿發(fā)酵提取物1聚乙烯醇15羧甲基纖維素0.15甘油3PEG15002甜菜堿2DL-泛醇0.4尿囊素0.1三乙醇胺0.2煙酰胺0.5乙醇6PEG40硬化蓖麻油0.3香料適量防腐劑適量色素適量蒸餾水余量合計100當(dāng)前第1頁1 2 3