本說明書涉及將外來粒子插入細胞以及用于插入的裝置。

背景技術(shù)：

1、體內(nèi)細胞追蹤與許多醫(yī)療應(yīng)用密切相關(guān)，例如，再生醫(yī)學(干細胞)植入和免疫療法(過繼性細胞轉(zhuǎn)移(act)或cart細胞療法(car-t))等。磁性標記已被證明是用于體內(nèi)細胞追蹤的最持久的成像標記之一，因為其信號不會隨時間的推移而發(fā)生放射性衰減(通常半衰期很短，只有幾小時)，也不會像光學染料那樣發(fā)生光漂白或快速消化。然而，現(xiàn)有的細胞磁性標記方法受到限制，標記時間長達24小時，以及對act和car-t中使用的非吞噬細胞的吸收能力差。較長的標記時間可能會對被標記的原代細胞產(chǎn)生毒性，導致被標記細胞的存活率降低?？梢詫擞浀募毎M行分揀，但費用昂貴，而且產(chǎn)量通常較低。已經(jīng)提出了微流體方法，但這些方法很難擴大規(guī)模，以容納臨床細胞療法所需的數(shù)千萬個細胞。使用抗體靶向或脂質(zhì)體涂層的載體方法大大增加了標記過程的成本和復雜性。

2、lewin等人(自然生物技術(shù)，2000年，18(4)：410-4，doi:10.1038/74464)描述了hivtat肽共軛磁性納米粒子和用于體內(nèi)成像的cd34+造血祖細胞吸收的標記方案。然而，所述方法的缺點是需要高濃度的納米粒子，導致大部分納米粒子作為廢物留在培養(yǎng)基中。這既不經(jīng)濟又低效，而且會給擴大規(guī)模帶來問題。

3、walczak?p等人(納米醫(yī)學：納米技術(shù)、生物學和醫(yī)學，2006，2(2)：89-94，doi：10.1016/j.nano.2006.01.003)介紹了使用標準電穿孔技術(shù)使膜通透，從而使神經(jīng)干細胞和白細胞有效吸收磁性納米粒子，用于細胞磁共振成像。不過，吸收效率并不高(每個細胞只有1-5pg鐵)。要進一步提高效率，需要更高的電壓設(shè)置(1kv或2.5kv/cm)和極短的脈沖，但這樣會導致較高的活力損失(20％)，從而降低整體效率。此外，市面上常見的電穿孔裝置僅適用于懸浮細胞，而對貼壁細胞進行高通量標記需要專門的設(shè)置。

4、kim?hs等人(生物醫(yī)學中的nmr，2010，23:514-22，doi:10.1002/nbm.1487)描述了通過生化方法將靶人間充質(zhì)干細胞與聚-l-賴氨酸培養(yǎng)，來評估三種基于氧化鐵的磁共振成像造影劑的標記效率。

5、cn111671921描述了一種利用類病毒粒子用含量子點的磁性粒子標記細胞的方法。然而，cn111671951的孵化時間較長，而且微米大小的磁性粒子非常大，很難擠入較小的細胞，如幼t淋巴細胞(直徑僅為6微米，只有30％的細胞質(zhì)容積能容納磁性粒子)。作者承認這一事實，并指出由于mpio尺寸較大，難以通過吞噬作用被細胞吸收，因此能被標記的細胞有限，主要集中在巨噬細胞和具有吞噬功能的細胞(例如，肝庫弗氏細胞)。

6、jp2009002685描述了一種使用定制明膠載體用磁性納米粒子標記紅細胞表面的方法。

7、kr1020090110076描述了一種用全氟化碳納米乳液中的納米粒子標記靶細胞，并在細胞磁共振成像中將粒子包裝到脂質(zhì)體中的方法。

8、上述現(xiàn)有方法通常效率不高或僅限于特定細胞類型，這些限制阻礙了磁性標記的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在第一方面，本說明書實施例提供了一種用粒子穿透細胞的方法，該方法包括：在容器的底端或接近容器的底端提供一層細胞；將多個粒子添加到容器中；以及施加力將多個粒子向容器的底端移動，使多個粒子中的至少一部分穿透到至少一部分細胞中。

2、在第二方面，本說明書實施例提供了一種用磁性粒子穿透細胞的裝置。該裝置包括具有底端的容器，用于在底端容納一細胞層；以及施力部件，施力部件被配置為施加力以將容器內(nèi)的多個磁性粒子向容器的底端移動，使多個磁性粒子中的至少一部分穿透至少一部分細胞中。

3、本說明書實施例提供的方法和裝置允許在標記中使用較低濃度的粒子(包括磁性納米粒子)，從而大大減少了粒子的浪費。眾所周知，在培養(yǎng)基中共同孵化納米粒子時，大部分納米粒子仍留在培養(yǎng)基中，但使用較低濃度會導致標記效率降低。本說明書實施例所述的方法和裝置可有效地實現(xiàn)高濃度、低用量的納米粒子。

技術(shù)特征：

1.一種用粒子穿透細胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述容器的所述底端呈錐形，優(yōu)選地，所述底端具有u形或v形的垂直橫截面。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述力包括由磁場施加的磁力，所述磁場從所述容器的頂部區(qū)域到所述容器的所述底端遞增，所述頂部區(qū)域與所述底端相對，并且其中所述多個粒子是磁性粒子。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁場從所述容器的所述頂部區(qū)域到所述容器的所述底端呈指數(shù)增加。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述磁力是在三個軸上的顯著磁力，所述磁力將所述多個粒子集中到所述容器的所述底端，其中，所述三個軸中的一個軸與所述容器的縱軸平行，并且所述三個軸在空間上彼此正交，優(yōu)選地，從所述容器的所述頂部區(qū)域到所述容器的所述底端遞增的所述磁場大于每毫米5毫特斯拉。

6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述磁力由磁性陣列中多個磁體中的一個磁體產(chǎn)生，其中，所述多個磁體以交替極性配置排列。

7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的方法，其特征在于，滿足以下條件中的至少一個：

8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述多個粒子包括氧化鐵粒子，或優(yōu)選地包含在葡聚糖外殼內(nèi)的氧化鐵粒子。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，滿足以下條件中的至少一個：

10.根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述力包括與所述磁力相結(jié)合的離心力。

11.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述力包括離心力。

12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，施加所述離心力包括將所述細胞離心至少1小時，優(yōu)選地最多3小時。

13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞層的濃度至少為每容器100,000個細胞。

14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其特征在于，所述粒子的密度高于所述細胞，優(yōu)選地，所述粒子的密度至少是所述細胞的10倍，更優(yōu)選地，所述粒子的密度至少是所述細胞的50倍，更優(yōu)選地，所述粒子的密度至少是所述細胞的100倍。

15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其特征在于，所述容器是多孔板的孔，優(yōu)選地，96孔板的孔。

16.根據(jù)權(quán)要1至15中任一項所述的方法，其特征在于，在所述容器的所述底端或接近所述容器的所述底端提供所述細胞層包括離心所述細胞，以在所述容器的所述底端或接近所述容器的所述底端處提供所述細胞層。

17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其特征在于，所述一層僅為單層，優(yōu)選地為致密蜂窩狀單層。

18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其特征在于，包括添加遞送載體，以增加所述粒子對所述細胞的穿透，其中，所述遞送載體選自抗體、脂質(zhì)體、配體和細胞穿透肽組成的組。

19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述遞送載體是細胞穿透肽，優(yōu)選地所述細胞穿透肽是tat肽，其中所述tat肽包括seq?id?no:1和連接體，所述連接體包括允許連接和共軛的任何合適的官能團。

20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述連接體包括氨基酸。

21.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其特征在于，所述容器沒有遞送載體。

22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞對所述粒子的自然吸收率較低。

23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述細胞選自淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和干細胞組成的組，優(yōu)選地，其中，所述淋巴細胞包括t細胞、b細胞或自然殺傷細胞。

24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項所述的方法，其特征在于，所述粒子為磁性粒子或磁性納米粒子，優(yōu)選地，流體動力學尺寸為10nm至500nm的磁性納米粒子。

25.一種用于用磁性粒子穿透細胞的裝置，其特征在于，所述裝置包括：具有底端的容器，用于在所述底端容納所述一層細胞；以及施力部件，所述施力部件被配置為施加力以將述容器內(nèi)的多個磁性粒子向所述容器的所述底端移動，從而使所述多個磁性粒子中的至少一部分穿透至少一部分所述細胞中。

26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的裝置，其特征在于，所述底端呈錐形，優(yōu)選地，所述底端具有u形或v形的垂直橫截面。

27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的裝置，其特征在于，所述施力部件包括磁性陣列，所述磁性陣列具有多個交替極性排列的磁體，所述磁性陣列被配置為施加磁力以將所述容器內(nèi)的所述磁性粒子向所述容器的所述底端移動，使至少一部分所述磁性粒子穿透到至少一部分所述細胞中。

28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其特征在于，所述磁性陣列置于所述容器的所述底端下方以施加所述磁力，所述磁力由磁場施加，所述磁場從所述容器的頂部區(qū)域到所述容器的所述底端遞增，其中，所述頂部區(qū)域與所述底端相對。

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的裝置，其特征在于，所述磁場從所述容器的所述頂部區(qū)域到所述容器的所述底端呈指數(shù)增加。

30.根據(jù)權(quán)利要求27至29中任一項所述的裝置，其特征在于，所述磁性陣列被配置為在三個軸上產(chǎn)生顯著磁力，所述磁力將所述磁性粒子集中到所述容器的所述底端，其中，所述三個軸中的一個軸與所述容器的縱軸平行，并且所述三個軸在空間上彼此正交，優(yōu)選地，從所述容器的所述頂部區(qū)域到所述容器的所述底端遞增的所述磁場大于每毫米5毫特斯拉。

31.根據(jù)權(quán)利要求27至30中任一項所述的裝置，其特征在于，所述磁力由所述多個磁體中的一個磁體施加。

32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項所述的裝置，其特征在于，所述容器是多孔板的孔，優(yōu)選地96孔板的孔。

技術(shù)總結(jié)
本說明書實施例涉及了一種用粒子穿透細胞的方法和裝置。該方法包括在容器的底端或接近容器的底端提供一層細胞；將多個粒子添加到容器中；以及施加力將多個粒子向容器的底端移動，使多個粒子中的至少一部分穿透到至少一部分細胞中。該裝置包括具有底端的容器，用于在底端容納一層細胞；以及施力部件，施力部件被配置為施加力，使容器內(nèi)的多個磁性粒子向容器的底端移動，從而用多個磁性粒子中的至少一部分穿透至少一部分細胞。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭智偉,戴榮恩,洛卡米特拉·普
受保護的技術(shù)使用者：新加坡科技研究局
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8