本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及一種治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的基因藥物及其制備方法和應用。

背景技術：

1、致心律失常性心肌病(arrhythmogenic?cardiomyopathy，acm)是一種由遺傳因素引起的心肌病，主要特征為心肌組織逐漸被脂肪和纖維化替代，導致心室心律失常和進行性心功能衰退。acm通常以右心室為主要受累部位，但也可以影響左心室。該病以家族性遺傳為主，常見的致病基因突變包括pkp2、dsg2、dsp、ctnna3等，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝異常，尤其是pnpla2基因突變，亦是acm的關鍵致病因子之一。

2、pnpla2(patatin-like?phospholipase?domain-containingprotein?2)基因編碼的蛋白質(zhì)主要負責催化三酰甘油的水解，是脂質(zhì)代謝中非常重要的酶。pnpla2的突變會導致脂質(zhì)代謝紊亂，進而引起心肌細胞中脂肪的沉積和心肌纖維化，這種病理改變顯著增加了患者的猝死風險。特別是pnpla2?c.g245a(p.g82d)突變，已被多項研究證實與致心律失常性心肌病(acm)的發(fā)生密切相關。根據(jù)研究，這種突變使得pnpla2酶活性喪失，導致心肌內(nèi)脂肪沉積，并觸發(fā)心臟的病理變化，嚴重影響心臟功能。acm的臨床表現(xiàn)包括心律失常、心肌肥厚、右心室擴大、心力衰竭等癥狀，且常在年輕患者中發(fā)病，通常在40歲左右發(fā)病，極大影響患者的生存質(zhì)量和預后。

3、目前，acm的治療方法有限，現(xiàn)有的治療手段主要集中在癥狀控制、藥物治療和心臟移植上。癥狀控制方面，主要通過抗心律失常藥物來緩解心律失常，改善心臟功能，然而這些藥物僅能緩解癥狀，不能根治疾病。對于心臟移植，它是終末期acm患者唯一的有效治療手段，盡管心臟移植可以顯著改善患者的生活質(zhì)量，但由于供體心臟的短缺，很多患者無法及時接受移植，且心臟移植本身也伴隨有免疫排斥等問題，患者的長期生存率和預后并不理想。當前的研究大多集中在結構蛋白突變引起的acm治療上，對于脂質(zhì)代謝紊亂這一病因并未給予足夠重視。尤其是針對pnpla2基因突變導致的acm，目前尚無有效的基因治療方案，現(xiàn)有的研究多數(shù)是單純修復結構蛋白基因，而非脂質(zhì)代謝方面的治療。

4、因此，目前缺乏一種能夠從根本上治愈acm、尤其是由pnpla2基因突變引起的acm的治療方案，亟需開發(fā)新的治療策略來解決脂質(zhì)代謝紊亂和心肌脂肪浸潤的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的基因藥物及其制備方法和應用。本發(fā)明基于aav9載體、采用心肌特異性啟動子ctnt的基因治療策略，通過修復脂質(zhì)代謝紊亂，恢復了pnpla2基因的功能，從而改善acm的病理改變。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

3、本發(fā)明提供了一種治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的基因藥物，所述基因藥物的有效成分包括穿梭質(zhì)粒；所述穿梭質(zhì)粒包括aav9載體和插入所述aav9載體上的pnpla2基因，所述pnpla2基因位于所述aav9載體上的ctnt啟動子下游。

4、優(yōu)選的，所述pnpla2基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

5、優(yōu)選的，所述aav9載體為phbaav載體。

6、優(yōu)選的，所述基因藥物為慢病毒包裝的病毒顆粒。

7、優(yōu)選的，所述基因藥物中病毒顆粒的滴度為1×1012～1×1013vg/ml。

8、本發(fā)明提供了上述技術方案所述的基因藥物的制備方法，包括以下步驟：

9、將穿梭質(zhì)粒、paav-rc質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒混合，得到三質(zhì)粒系統(tǒng)；

10、將所述三質(zhì)粒系統(tǒng)在hek293t細胞中進行病毒包裝和純化，得到所述基因藥物。

11、優(yōu)選的，所述穿梭質(zhì)粒、paav-rc質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒的質(zhì)量比為1：1：2。

12、優(yōu)選的，所述病毒包裝的試劑包括脂質(zhì)體；所述三質(zhì)粒系統(tǒng)和脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為40μg：120μl。

13、本發(fā)明提供了上述技術方案所述的基因藥物或利用上述技術方案所述的制備方法制備得到的基因藥物在制備治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的產(chǎn)品中的應用。

14、優(yōu)選的，所述pnpla2突變?yōu)閜npla2?c.245g>a(p.g82d)。

15、有益效果：

16、本發(fā)明提供了一種治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的基因藥物，所述基因藥物的有效成分包括穿梭質(zhì)粒；所述穿梭質(zhì)粒包括aav9載體和插入所述aav9載體上的pnpla2基因，所述pnpla2基因位于所述aav9載體上的ctnt啟動子下游。本發(fā)明通過aav9載體遞送功能正常的pnpla2基因，修復突變導致的脂質(zhì)代謝紊亂，減少心肌內(nèi)脂肪沉積，進而改善acm的病理改變。通過恢復pnpla2基因的功能，能夠有效抑制心肌纖維化的進程，改善心臟功能。本發(fā)明采用心肌特異性啟動子ctnt，以確保pnpla2基因僅在心肌中表達，從而提高基因治療的靶向性，避免全身性表達引起的副作用。這一策略能夠有效減少基因治療的副作用，確保治療的精準性和安全性。

技術特征：

1.一種治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物的有效成分包括穿梭質(zhì)粒；所述穿梭質(zhì)粒包括aav9載體和插入所述aav9載體上的pnpla2基因，所述pnpla2基因位于所述aav9載體上的ctnt啟動子下游。

2.根據(jù)權利要求1所述的基因藥物，其特征在于，所述pnpla2基因的核苷酸序列如seqid?no.1所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的基因藥物，其特征在于，所述aav9載體為phbaav載體。

4.根據(jù)權利要求1～3任一項所述的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物為慢病毒包裝的病毒顆粒。

5.根據(jù)權利要求4所述的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物中病毒顆粒的滴度為1×1012～1×1013vg/ml。

6.權利要求1～5任一項所述的基因藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述穿梭質(zhì)粒、paav-rc質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒的質(zhì)量比為1：1：2。

8.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述病毒包裝的試劑包括脂質(zhì)體；所述三質(zhì)粒系統(tǒng)和脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為40μg：120μl。

9.權利要求1～5任一項所述的基因藥物或利用權利要求6～8任一項所述的制備方法制備得到的基因藥物在制備治療pnpla2突變致心律失常性心肌病的產(chǎn)品中的應用。

10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，所述pnpla2突變?yōu)閜npla2c.245g>a(p.g82d)。

技術總結
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種治療PNPLA2突變致心律失常性心肌病的基因藥物及其制備方法和應用。本發(fā)明提供的基因藥物的有效成分包括穿梭質(zhì)粒；所述穿梭質(zhì)粒包括AAV9載體和PNPLA2基因。本發(fā)明通過AAV9載體遞送功能正常的PNPLA2基因，修復突變導致的脂質(zhì)代謝紊亂，減少心肌內(nèi)脂肪沉積，進而改善ACM的病理改變。通過恢復PNPLA2基因的功能，能夠有效抑制心肌纖維化的進程，改善心臟功能。本發(fā)明采用心肌特異性啟動子cTnT，以確保PNPLA2基因僅在心肌中表達，從而提高基因治療的靶向性，避免全身性表達引起的副作用。這一策略能夠有效減少基因治療的副作用，確保治療的精準性和安全性。

技術研發(fā)人員：宋江平,章秀林,王驄睿,王一凡
受保護的技術使用者：中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/8