本發(fā)明涉及傳感平臺檢測領(lǐng)域，更具體的說是依賴鋅離子連接作為擴增生物催化劑的脫氧核酶為分析microrna(mirna)熒光提出一個傳感平臺，利用這個平臺為檢測mirna構(gòu)建一個通用的路徑。

背景技術(shù)：

癌癥是目前全球都在攻克的難題，是一個造成死亡的主要原因，每年死于癌癥的患者很多，所以癌癥的早期診斷變得尤為重要，mirna作為基因表達的重要調(diào)節(jié)器，腫瘤發(fā)生時，mirna調(diào)節(jié)致癌與腫瘤抑制途徑。在某些腫瘤中單個mirna常發(fā)生復(fù)發(fā)性遺傳和表觀遺傳的改變，相關(guān)研究也進一步闡明了公認的致癌和抑癌基因的作用機制。mirna不僅和癌癥的發(fā)生有關(guān)，而且能夠為癌癥的相關(guān)治療提供新的工具和希望。let-7在人類胚胎發(fā)育時期很難被檢測到，但在成年時期變的相當(dāng)豐富，在人類胚胎細胞分化過程中表達明顯增加。let-7在肺癌組織中表達降低，恢復(fù)其正常表達有明顯的腫官抑制作用。因此，我們現(xiàn)在需要發(fā)展更簡單、準確、快捷、靈敏度高、選擇性好的檢測方法，用于癌癥早期的檢測判斷。

mirna表達的專一信號已經(jīng)在臨床組織樣本中被發(fā)現(xiàn)，而且mirna比mrna更穩(wěn)定，故可以將mirna作為診斷中新型的生物標記物。同時研究表明mirna能存在于極端的環(huán)境中，如酶促降解、冷凍、熔化、強酸強堿環(huán)境中。另外，mirna在所有的體液和分泌物中也能被檢測出來，包括尿液、排泄物、唾液、眼淚和羊水等。mirna的檢測分析技術(shù)對推進mirna生物功能的進一步研究至關(guān)重要，并將形成以mirna為疾病標志物的新診斷技術(shù)。但是絕大部分mirna分子在細胞內(nèi)的表達程度比較低，同源mirna之間相似程度又高，所以發(fā)展簡單、快速、準確、高靈敏度、高選擇性的mirna的檢測方法對于mirna生物功能的研究及以mirna為生物標志物的疾病診斷都有重要意義。

檢測mirna的傳統(tǒng)方法有northern印跡法，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)和微陣列法。然而，這些方法都有一些缺點。例如，northern印跡是長而復(fù)雜的程序，需要放射性標記并且檢測限通常低，而rt-pcr和微陣列具有良好的靈敏度，但需要昂貴的儀器。因此，我們需要發(fā)展靈敏度高、成本低的檢測方法，現(xiàn)在出現(xiàn)了許多新的檢測方法，如環(huán)誘導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、滾環(huán)擴增技術(shù)、分子信標等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是依賴鋅離子連接作為擴增生物催化劑的脫氧核酶為分析microrna(mirna)熒光提出一個傳感平臺，利用這個平臺為檢測mirna構(gòu)建一個通用的路徑。

一種酶性dna機器用于mirna檢測的方法，其特征是包括以下步驟：

1.1測定熒光光譜溶液的制備

所有的檢測都在包含100nm氯化鈉10nm的氯化鎂的10nm4-(2-乙基)n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸鈉鹽緩沖劑(ph=7.0)中進行；工作溶液包括0.5μm的脫氧核酶亞基(4)和(5)，1μm底物亞基(2)和(3)，發(fā)夾探針的0.5μm(8)，1mm鋅離子，再加入不同濃度的目標mirna，混合溶液繼續(xù)培育擴增1.5小時在25°c的環(huán)境下，各樣品的體積均為20μl，連接后，樣品被稀釋到50μl；其中底物(2)需要用咪唑(ph=6.0，用hcl調(diào)節(jié))、edc·hcl修飾；方法：40μl10μm的底物(2)與5μl0.1μm咪唑和5μl0.1μmedc·hcl，25°c培養(yǎng)2小時，再利用色譜分析柱(g-25)純化底物；

1.2形成再生脫氧核酶

脫氧核酶序列(4)與改良咪唑底物亞基(2)和羥基化的亞基(3)結(jié)合，在鋅離子的存在下連接到3′和5′各自底物亞基的末端；通過發(fā)夾域連接脫氧核酶是穩(wěn)定的，包括亞基(4)與底物亞基(2)脫氧核酶序列的一部分結(jié)合；脫氧核酶(5)脫氧核酶的第二段序列，結(jié)構(gòu)域(i)的一個擴展的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(ii)；得到結(jié)合第二個底物亞基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(ii)打開，使2個脫氧核酶和底物亞基(4)/(2)和(5)/(3)自組裝在一起；在鋅離子的存在下，脫氧核酶是有活性的，導(dǎo)致連接亞基(2)和(3)形成連接產(chǎn)品(7)；

1.3第一擴增步驟

在步驟1.2基礎(chǔ)上引入一個“輔助”的核酸(6)，“輔助”核酸(6)與鋅離子連接脫氧核酶亞基形成的一個更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；由連接產(chǎn)物與鋅離子脫氧核酶亞基和(7)/(8)雙相組成的連接產(chǎn)物打開發(fā)夾；將連接物(7)從鋅離子脫氧核酶亞基中的催化分離，“輔助”核酸(6)與鋅離子連接脫氧核酶亞基互補；由于“輔助”核酸(6)和脫氧核酶單位之間的穩(wěn)定雙相結(jié)構(gòu)，鏈置換過程，導(dǎo)致形成“m”結(jié)構(gòu)并且釋放原本沒有產(chǎn)生熒光信號的連接產(chǎn)品，連接產(chǎn)品再打開發(fā)夾(8)，產(chǎn)生熒光；

1.4第二擴增步驟

混合物由連接產(chǎn)物(7)和脫氧核酶亞基之間雙工結(jié)構(gòu)組成，并且在(8)和連接產(chǎn)物(7)之間形成的雙工結(jié)構(gòu)是受nt.bspqi切口酶的影響，nt.bspqi切口酶切割在(7)/(8)的復(fù)式結(jié)構(gòu)中(8)的單鏈區(qū)域；這導(dǎo)致分離為淬滅劑標記的核酸片段(9)，熒光標記片段(10)，和再生連接產(chǎn)品(7)，進一步打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)(8)；這是切割復(fù)式結(jié)構(gòu)(7)/(8)再生連接產(chǎn)物，從而循環(huán)打開發(fā)夾(8)和催化再生熒光標記片段(10)，通過nt.bspqi切割酶介導(dǎo)再生連接產(chǎn)物；

1.5目標物含量的測定

目標物的濃度在0-20nm的范圍內(nèi)符合方程y=916.65+21.46x，r=0.79686；目標物的濃度在20-200nm的范圍內(nèi)符合方程y=1225.96+4.18x，r=0.99492；由這兩個方程我們可以利用熒光信號的強度來計算溶液中目標物的含量。

本發(fā)明的有益效果

(1)利用分子信標標記和熒光猝滅基團與環(huán)誘導(dǎo)等溫擴增技術(shù)相結(jié)合的方法檢測mirna(let-7a)的熒光信號；

(2)對于mirna生物功能的研究及以疾病診斷都有重要意義；

(3)本發(fā)明所述方法檢測成本低、靈敏度高。

附圖說明

圖1為本文所述方法的反應(yīng)原理圖。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例和附圖進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施。

實施例1

一種酶性dna機器用于mirna檢測的方法，其特征是包括以下步驟：

1.1測定熒光光譜溶液的制備

所有的檢測都在包含100nm氯化鈉10nm的氯化鎂的10nm4–(2-羥乙基)n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸鈉鹽緩沖劑(ph=7.0)中進行；工作溶液包括0.5μm的脫氧核酶亞基(4)和(5)，1μm底物亞基(2)和(3)，發(fā)夾探針的0.5μm(8)，1mm鋅離子，再加入不同濃度的目標mirna，混合溶液繼續(xù)培育擴增1.5小時在25°c的環(huán)境下，各樣品的體積均為20μl，連接后，樣品被稀釋到50μl；其中底物(2)需要用咪唑(ph=6.0，用hcl調(diào)節(jié))、edc·hcl修飾；方法：40μl10μm的底物(2)與5μl0.1μm咪唑和5μl0.1μmedc·hcl，25°c培養(yǎng)2小時，再利用色譜分析柱(g-25)純化底物；

1.2形成再生脫氧核酶

脫氧核酶序列(4)與改良咪唑底物亞基(2)和羥基化的亞基(3)結(jié)合，在鋅離子的存在下連接到3′和5′各自底物亞基的末端；通過發(fā)夾域連接脫氧核酶是穩(wěn)定的，包括亞基(4)與底物亞基(2)脫氧核酶序列的一部分結(jié)合；脫氧核酶(5)脫氧核酶的第二段序列，結(jié)構(gòu)域(i)的一個擴展的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(ii)；得到結(jié)合第二個底物亞基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(ii)打開，使2個脫氧核酶和底物亞基(4)/(2)和(5)/(3)自組裝在一起；在鋅離子的存在下，脫氧核酶是有活性的，導(dǎo)致連接亞基(2)和(3)形成連接產(chǎn)品(7)；

1.3第一擴增步驟

在步驟1.2基礎(chǔ)上引入一個“輔助”的核酸(6)，“輔助”核酸(6)與鋅離子連接脫氧核酶亞基形成的一個更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；由連接產(chǎn)物與鋅離子脫氧核酶亞基和(7)/(8)雙相組成的連接產(chǎn)物打開發(fā)夾；將連接物(7)從鋅離子脫氧核酶亞基中的催化分離，“輔助”核酸(6)與鋅離子連接脫氧核酶亞基互補；由于“輔助”核酸(6)和脫氧核酶單位之間的穩(wěn)定雙相結(jié)構(gòu)，鏈置換過程，導(dǎo)致形成“m”結(jié)構(gòu)并且釋放原本沒有產(chǎn)生熒光信號的連接產(chǎn)品，連接產(chǎn)品再打開發(fā)夾(8)，產(chǎn)生熒光；

1.4第二擴增步驟

混合物由連接產(chǎn)物(7)和脫氧核酶亞基之間雙工結(jié)構(gòu)組成，并且在(8)和連接產(chǎn)物(7)之間形成的雙工結(jié)構(gòu)是受nt.bspqi切口酶的影響，nt.bspqi切口酶切割在(7)/(8)的復(fù)式結(jié)構(gòu)中(8)的單鏈區(qū)域；這導(dǎo)致分離為淬滅劑標記的核酸片段(9)，熒光標記片段(10)，和再生連接產(chǎn)品(7)，進一步打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)(8)；這是切割復(fù)式結(jié)構(gòu)(7)/(8)再生連接產(chǎn)物，從而循環(huán)打開發(fā)夾(8)和催化再生熒光標記片段(10)，通過nt.bspqi切割酶介導(dǎo)再生連接產(chǎn)物；

1.5目標物含量的測定

目標物的濃度在0-20nm的范圍內(nèi)符合方程y=916.65+21.46x，r=0.79686；目標物的濃度在20-200nm的范圍內(nèi)符合方程y=1225.96+4.18x，r=0.99492；由這兩個方程我們可以利用熒光信號的強度來計算溶液中目標物的含量。

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<110>濟南大學(xué)

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