本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的組合物及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、呼吸道感染是當(dāng)今重要的全球性公共衛(wèi)生問題，也是臨床上最為常見的感染性疾病。呼吸道感染性病原體種類繁多，主要包括病原體、細(xì)菌、衣原體及支原體等；其傳播途徑復(fù)雜，傳播速度快，不僅有較強(qiáng)的傳染性，而且可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至可導(dǎo)致死亡；此外，其癥狀多相似，潛伏期短，發(fā)病急；其中，流行性感冒病毒(influenza?virus)和呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus，rsv)為臨床常見的、重要的呼吸道病毒。

2、流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是一種小型病毒，體內(nèi)只有11個(gè)基因，由rna構(gòu)成。人流感病毒可分為甲型流感病毒(influenza?a?virus，flua)、乙型流感病毒(influenza?bvirus，flub)和丙型流感病毒(influenza?c?virus，fluc)三種類型，其中甲型流感病毒主要感染水禽及人類，但易發(fā)生變異，目前3種病毒型可對人類造成感染，并多次引起世界性大流行。甲型流感病毒的分類是根據(jù)其表面蛋白的不同，主要是血球凝集素(h)和神經(jīng)氨酸酶(n)，共有18種h和11種n；乙型流感只感染人類，近年來較為流行的有yamagata和victoria系，相較于甲型流感病毒，乙型流感病毒更容易引起較為嚴(yán)重的合并癥。甲流和乙流的優(yōu)勢毒株會(huì)一同在南北半球的冬季流行，它們會(huì)感染全部人口的一半，并使10％到15％的人得病。呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒，主要通過呼吸道侵入人體，并通過空氣(飛沫、塵埃)傳播，病毒主要在鼻咽上皮細(xì)胞中增殖。呼吸道合胞病毒是5歲以內(nèi)兒童病毒性肺炎的最主要病原體，也是嬰兒猝死的病因之一。兒童對rsv普遍易感，且再感染率很高。成人急性感染也很常見，老年人可引起嚴(yán)重肺炎，并發(fā)展為成人呼吸窘迫綜合征(ards)。

3、在傳染性疾病流行期，早期快速診斷對于患者治療和疫情防控至關(guān)重要，目前flua、flub和rsv常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測、免疫熒光法等。當(dāng)2009甲型h1n1流感病毒在全球范圍內(nèi)流行后，世界衛(wèi)生組織(who)和美國疾病預(yù)防控制中心(cdc)推薦的實(shí)驗(yàn)室檢測方法均為實(shí)時(shí)熒光pcr法。但傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光法需要進(jìn)行樣本核酸提取，操作復(fù)雜、耗時(shí)較長，容易造成核酸損失而導(dǎo)致靈敏度不高、檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確；另外，傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光法特異性低，導(dǎo)致檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供一種用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的組合物及其試劑盒，以解決傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光法靈敏度不高、特異性低、檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確的問題。

2、本技術(shù)的第一方面，提供一種用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的組合物，包括：引物對和與其對應(yīng)的探針；

3、所述引物對包括：針對甲型流感病毒的引物對1，其核苷酸序列如seq?id?no.01和seq?id?no.02所示；針對乙型流感病毒的引物對2，其核苷酸序列如seq?id?no.03和seq?idno.04所示；針對呼吸道合胞病毒的引物對3，其核苷酸序列如seq?id?no.05和seq?idno.06所示；

4、所述探針包括：針對甲型流感病毒的特異性探針1，其核苷酸序列如seq?id?no.07所示；針對乙型流感病毒的特異性探針2，其核苷酸序列如seq?id?no.08所示；針對呼吸道合胞病毒的特異性探針3，其核苷酸序列如seq?id?no.09所示；

5、seq?id?no.01：5′-ttccatggggccaaggaggtgt-3′；

6、seq?id?no.02：5′-acactagaccaaaagcagctt-3′；

7、seq?id?no.03：5′-agaactagcagaaaaattaca-3′；

8、seq?id?no.04：5′-agaggcaccaattagtgctt-3′；

9、seq?id?no.05：5′-aacaagatggggcaaatat-3′；

10、seq?id?no.06：5′-atctttttctagaacattgt-3′；

11、seq?id?no.07：5′-gctattcaactggtgcacttgcca-3′；

12、seq?id?no.08：5′-gtgggaaagaatttgacctagactct-3′；

13、seq?id?no.09：5′-gaaacatacgtgaacaagcttca-3′。

14、可選的，所述特異性探針1、特異性探針2、特異性探針3均連接有熒光標(biāo)記基團(tuán)，特異性探針1、特異性探針2、特異性探針3上的熒光標(biāo)記基團(tuán)在pcr過程中所產(chǎn)生的熒光信號不同。

15、可選的，所述特異性探針1連接fam熒光標(biāo)記基團(tuán)，特異性探針2連接vic熒光標(biāo)記基團(tuán)，特異性探針3連接cy5熒光標(biāo)記基團(tuán)。

16、可選的，所述引物對還包括內(nèi)標(biāo)引物對，其核苷酸序列如seq?id?no.10和seq?idno.11所示；所述探針還包括內(nèi)標(biāo)特異性探針，其核苷酸序列如seq?id?no.012所示；

17、seq?id?no.10：5′-ctgctcgcggatacccgtac-3′；

18、seq?id?no.11：5′-tacgcacttcggagtggctaac-3′；

19、seq?id?no.12：5′-gcacgacagtggtcgctacatag-3′。

20、本技術(shù)的第二方面，提供一種用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的試劑盒，包括第一方面任意一種實(shí)現(xiàn)方式提供的用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的組合物。

21、可選的，所述組合物中引物對1、引物對2以及引物對3的每條引物的濃度為0.05～0.1μm。

22、可選的，所述組合物中特異性探針1、特異性探針2以及特異性探針3的濃度為0.02～0.06μm。

23、可選的，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、陽性對照品、陰性對照品以及保存液。

24、可選的，所述保存液包括：異胍鹽、海藻糖、tris-hcl、dmso和甜菜堿和peg20000。

25、可選的，所述pcr緩沖液包括：tris-hcl、kcl、mgcl2和dntps。

26、本發(fā)明公開了一種用于甲乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒檢測的組合物及其試劑盒，所述組合物包括：引物對和與其對應(yīng)的探針；所述引物對包括：針對甲型流感病毒的引物對1，針對乙型流感病毒的引物對2，以及針對呼吸道合胞病毒的引物對3；所述探針包括：針對甲型流感病毒的特異性探針1，針對乙型流感病毒的特異性探針2，以及針對呼吸道合胞病毒的特異性探針3。本發(fā)明提供的引物和探針組合，具有靈敏度高、特異性高、檢測結(jié)果高度準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，且本發(fā)明的試劑盒可以滿足檢測限不高于200copies/ml。進(jìn)一步地，本發(fā)明創(chuàng)新性地在采樣管的保存液中添加核酸提取試劑，可免去樣本抽提步驟，采樣后可直接取樣上機(jī)，快速擴(kuò)增僅需30分鐘即可出結(jié)果。本發(fā)明的保存液中優(yōu)選了海藻糖、甜菜堿等pcr增強(qiáng)劑組分，采用本發(fā)明所述的組合物制成的試劑盒具有較強(qiáng)抗干擾能力。