本公開涉及新型成簇組合物和方法，特別地用于測序。序列表本申請包含序列表，該序列表已以xml格式電子提交并且據(jù)此全文以引用方式并入。創(chuàng)建于2023年9月22日的所述xml副本被命名為85491_08600_pct.xml并且大小為16.4千字節(jié)。

背景技術(shù)：

1、對生物樣品中存在的分析物(諸如核酸序列)的檢測已被用作鑒定和分類微生物、診斷傳染病、檢測和表征遺傳異常、鑒定與癌癥相關(guān)聯(lián)的遺傳變化、研究對疾病的遺傳易感性、測量對各種類型的治療的反應(yīng)和全外顯子組測序(僅舉幾例)的方法。用于檢測生物樣品中的核酸序列的常用技術(shù)是核酸擴增和測序。

2、核酸擴增方法是已知的，該方法允許將擴增產(chǎn)物固定在固體載體上，以便形成由簇或“集落”組成的陣列，該簇或“集落”由多個相同的固定化多核苷酸鏈和多個相同的固定化互補鏈形成。根據(jù)這些方法制備的簇陣列上的dna集落中存在的核酸分子可提供用于測序反應(yīng)的模板。

3、一種用于對多核苷酸模板進行測序的方法涉及使用dna聚合酶進行多次延伸反應(yīng)，以將標(biāo)記的核苷酸連續(xù)地摻入模板鏈中。在此類“邊合成邊測序”反應(yīng)中，通過連續(xù)摻入與模板鏈互補的單獨核苷酸在5'至3'方向上構(gòu)建與模板鏈堿基配對的新核苷酸鏈。

4、焦磷酸酶先前已被描述用于測序反應(yīng)。例如，us?5744312?a描述了一種測序組合物，其包含含有苯丙氨酸至酪氨酸突變的dna聚合酶與焦磷酸酶的組合。us2012004115?a1描述了使用珠固定的海岸嗜熱球菌(t.litoralis)和aae?ppi-ase的測序結(jié)果。

5、然而，新的成簇組合物的開發(fā)可能更具挑戰(zhàn)性，因為需要考慮其他因素(例如，維持各個簇的單克隆性和高密度/強度)。

6、仍需要開發(fā)新的成簇組合物和方法，其可用于改善成簇并因此增加測序運行的通量和準確性。本公開解決了這種需要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在本公開的一個方面，提供了一種成簇組合物，其包含無機焦磷酸酶(在本文中也稱為ppiase)。

2、優(yōu)選地，該組合物包含濃度為約0.01μm至約1000μm、約0.1μm至約100μm、約0.5μm至約50μm、約1μm至約20μm或約2μm至約10μm的無機焦磷酸酶。

3、該組合物還可包含選自由以下項組成的組中的至少一種：重組酶、單鏈核苷酸結(jié)合蛋白、聚合酶、核苷酸三磷酸(ntp)、產(chǎn)生atp的底物和產(chǎn)生atp的酶。

4、該組合物還可包含選自由以下項組成的組中的至少一種：重組酶、ntp和單鏈核苷酸結(jié)合(ssb)蛋白。

5、聚合酶可以是dna聚合酶i，并且重組酶可以是重組酶a。

6、該組合物可以不包含peg。

7、該組合物可包含緩沖劑，其中優(yōu)選地，該組合物被緩沖至約6.0至約9.0，優(yōu)選約6.5至約8.8，更優(yōu)選約7.5至約8.7，甚至更優(yōu)選約8.3至約8.6的ph。

8、該組合物可以是再合成組合物。

9、在另一個方面，提供了一種嗜熱成簇組合物，其中該組合物包含嗜熱無機焦磷酸酶。

10、在另一個方面，提供了一種嗜溫成簇組合物，其中該組合物包含嗜溫?zé)o機焦磷酸酶。

11、在另一個方面，提供一種試劑盒，其包含成簇組合物、嗜熱成簇組合物或嗜溫成簇組合物。

12、該試劑盒還可包含金屬輔因子組合物，優(yōu)選地其中該金屬輔因子組合物包含鎂離子。

13、成簇組合物、嗜熱成簇組合物、嗜溫成簇組合物或試劑盒可以不包含長度為18個至22個堿基對的引物。

14、在另一方面，提供了用于擴增核酸序列和/或?qū)怂嵝蛄羞M行測序的成簇組合物、嗜熱成簇組合物或嗜溫成簇組合物。

15、在另一個方面，提供了一種擴增靶核酸模板的方法，該方法包括在成簇期間減少或去除無機焦磷酸鹽。

16、在另一個方面，提供了一種增強核酸擴增反應(yīng)的成簇動力學(xué)的方法，該方法包括去除無機焦磷酸酶或降低無機焦磷酸酶的水平。

17、該方法可以包括添加成簇組合物、嗜熱成簇組合物或嗜溫成簇組合物。

18、核酸成簇可以在約50℃至約75℃，優(yōu)選約75℃的溫度下進行。

19、該方法可包括僅添加一次成簇組合物。

20、在另一個方面，提供了一種對核酸序列進行測序的方法，其中該方法包括使用如本文所述的方法擴增核酸模板；以及對所擴增的核酸模板進行測序。

21、對所擴增的核酸模板進行測序的步驟可以包括進行第一測序讀取和第二測序讀取。

22、對所擴增的核酸模板進行測序的步驟可以使用邊合成邊測序技術(shù)(sequencing-by-synthesis?technique)或邊連接邊測序技術(shù)(sequencing-by-ligation?technique)來進行。

23、該方法可以在約50℃至約75℃，優(yōu)選約75℃的溫度下進行。

24、應(yīng)理解，如本文中所描述的本公開的方面中的每一者的任何相應(yīng)特征/示例可以任何適當(dāng)組合一起實施，并且來自這些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以與如本文中所描述的其他(多個)方面的特征中的任一者以任何適當(dāng)組合一起實施，以實現(xiàn)如本文中所描述的益處。

1.一種成簇組合物，包含無機焦磷酸酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含濃度為約0.01μm至約1000μm、約0.1μm至約100μm、約0.5μm至約50μm、約1μm至約20μm或約2μm至約10μm的無機焦磷酸酶。

3.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物還包含選自由以下項組成的組中的至少一種：重組酶、單鏈核苷酸結(jié)合蛋白、聚合酶、核苷酸三磷酸(ntp)、產(chǎn)生atp的底物和產(chǎn)生atp的酶。

4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物還包含選自由以下項組成的組中的至少一種：重組酶、ntp和單鏈核苷酸結(jié)合(ssb)蛋白。

5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述聚合酶是dna聚合酶i并且所述重組酶是重組酶a。

6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物不包含peg。

7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物包含緩沖劑，并且其中優(yōu)選地，所述組合物被緩沖至約6.0至約9.0，優(yōu)選約6.5至約8.8，更優(yōu)選約7.5至約8.7，甚至更優(yōu)選約8.3至約8.6的ph。

8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物是再合成組合物。

9.一種嗜熱成簇組合物，其中所述組合物包含嗜熱無機焦磷酸酶。

10.一種嗜溫成簇組合物，其中所述組合物包含嗜溫?zé)o機焦磷酸酶。

11.一種試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的成簇組合物、根據(jù)權(quán)利要求9所述的嗜熱成簇組合物或根據(jù)權(quán)利要求10所述的嗜溫成簇組合物。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含金屬輔因子組合物，優(yōu)選地其中所述金屬輔因子組合物包含鎂離子。

13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的成簇組合物、根據(jù)權(quán)利要求9所述的嗜熱成簇組合物或根據(jù)權(quán)利要求10所述的嗜溫成簇組合物或根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述組合物不包含長度為18個至22個堿基對的引物。

14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的成簇組合物、根據(jù)權(quán)利要求9所述的嗜熱成簇組合物或根據(jù)權(quán)利要求10所述的嗜溫成簇組合物用于擴增核酸序列和/或?qū)怂嵝蛄羞M行測序的用途。

15.一種擴增靶核酸模板的方法，所述方法包括在成簇期間減少或去除無機焦磷酸鹽。

16.一種增強核酸擴增反應(yīng)的成簇動力學(xué)的方法，所述方法包括去除無機焦磷酸酶或降低無機焦磷酸酶的水平。

17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述方法包括添加根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的成簇組合物、根據(jù)權(quán)利要求9所述的嗜熱成簇組合物或根據(jù)權(quán)利要求10所述的嗜溫成簇組合物。

18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中核酸成簇在約50℃至約75℃，優(yōu)選約75℃的溫度下進行。

19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項任一項所述的方法，其中所述方法包括僅添加一次所述成簇組合物。

20.一種對核酸序列進行測序的方法，其中所述方法包括：

21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中對所擴增的核酸模板進行測序的步驟包括進行第一測序讀取和第二測序讀取。

22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中對所擴增的核酸模板進行測序的步驟是使用邊合成邊測序技術(shù)或邊連接邊測序技術(shù)進行的。

23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項所述的方法，其中所述方法在約50℃至約75℃，優(yōu)選約75℃的溫度下進行。