本發(fā)明涉及熒光探針，具體涉及基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、次氯酸根主要由線粒體中的過氧化氫和氯離子反應(yīng)產(chǎn)生。作為最重要的活性氧物種之一，次氯酸根參與多種生理過程，其過量存在與許多疾病有關(guān)。羧酸酯酶（ces）作為一種絲氨酸水解酶，在各種酯和酰胺分子的代謝中同樣起著重要的作用。然而，羧酸酯酶功能障礙可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化、膽固醇誘導(dǎo)的肝損傷和ii型糖尿病等。研究表明，羧酸酯酶主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中。線粒體不僅在細(xì)胞生理過程中起著重要作用，而且其結(jié)構(gòu)與功能的變化與疾病之間有著密切的關(guān)系。因此，對活細(xì)胞中次氯酸根和羧酸酯酶的有效檢測，特別是對線粒體等亞細(xì)胞的細(xì)胞器中次氯酸根和羧酸酯酶的檢測，對了解它們的生理和病理效應(yīng)具有重要意義。

2、近來，熒光探針因其高靈敏度、瞬時響應(yīng)和易于操作等優(yōu)點，引起人們的廣泛關(guān)注。在這方面，目前已經(jīng)利用各種熒光團(tuán)（例如香豆素、熒光素、羅丹明、花菁、硼-二吡咯亞甲基和1,8-萘酰亞胺）開發(fā)了許多用于次氯酸根和羧酸酯酶的單次熒光檢測的一對一探針。然而，可以同時識別次氯酸根和羧酸酯酶的熒光探針還未見報道，比較而言，這種一對二的熒光探針比一對一類型的熒光探針更有應(yīng)用前景，成本更低。盡管已經(jīng)開發(fā)了一些針對線粒體靶向的次氯酸根探針，但用于檢測線粒體羧酸酯酶的探針仍然很少。水溶性差也是目前的大多數(shù)氯酸根/羧酸酯酶探針都存在的問題。因此，設(shè)計可同時檢測次氯酸根和羧酸酯酶的水溶性線粒體靶向探針的需求仍然很大。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，以乙?；鳛轸人狨ッ傅淖R別位點，末端芐基頻哪醇酯作為次氯酸根的反應(yīng)位點，制備出能夠同時響應(yīng)次氯酸根和羧酸酯酶的開-關(guān)和比率熒光探針；此外，吡啶鹽提供了一個有效的線粒體靶向位點，這使得該探針能夠檢測活細(xì)胞中的線粒體次氯酸根和羧酸酯酶。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針，其具有如下結(jié)構(gòu)：

4、。

5、第二方面，本發(fā)明提供了上述基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

6、s1將4-甲基吡啶加入對羥基苯甲醛的有機溶液中，得混合物；

7、s2將混合物回流攪拌反應(yīng)后，蒸發(fā)除去溶劑，得粗品；將粗品溶解在ch2cl2中，并洗滌后干燥；在真空中脫除溶劑，重結(jié)晶，得到化合物a；

8、s3將化合物a溶解于有機溶劑中，與4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯在室溫下反應(yīng)；

9、s4反應(yīng)完成后，將沉淀物過濾并在真空中干燥，產(chǎn)物重結(jié)晶，得到基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針。

10、優(yōu)選的，步驟s1中，有機溶液的溶劑為乙酸酐。

11、優(yōu)選的，步驟s1中，4-甲基吡啶與對羥基苯甲醛的摩爾比為1:（0.6-1）。

12、優(yōu)選的，步驟s2中，回流攪拌反應(yīng)時間為20-25h。

13、優(yōu)選的，步驟s2中，用飽和nahco3水溶液洗滌，然后用無水na2so4干燥。

14、優(yōu)選的，步驟s2中，從體積比為7:3的乙醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到化合物a。

15、優(yōu)選的，步驟s3中，有機溶劑為乙腈，化合物a與4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯的摩爾比為1:（1-1.2）。

16、優(yōu)選的，步驟s3中，反應(yīng)時間為3-5h。

17、第三方面，本發(fā)明提供了上述基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的應(yīng)用，所述基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針作為次氯酸根和羧酸酯酶熒光探針，應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體熒光成像。

18、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

19、1.本發(fā)明通過縮合反應(yīng)制備基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針，原料易得，合成和后處理方法簡單，所制備的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的純化收率可達(dá)68%以上。本發(fā)明制備的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針，在多種常見陰陽離子、氨基酸和生物酶物種中，對次氯酸根和羧酸酯酶表現(xiàn)出較高的熒光識別性能。將該熒光探針的pbs緩沖溶液滴定不同濃度的次氯酸根和羧酸酯酶，次氯酸根與f460在0-110μμ的檢測范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)，檢測限為65nμ；羧酸酯酶與f510/f460在0-0.018u/ml的酶濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的羧酸酯酶濃度依賴關(guān)系，對羧酸酯酶的檢測限為1.1×10-6u/ml。因此本發(fā)明制備的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針可以用于次氯酸根和羧酸酯酶定量檢測。

20、2.本發(fā)明制備的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針在純pbs緩沖溶液中，由于分子間電荷轉(zhuǎn)移（ict）效應(yīng)很弱而顯示出很強的藍(lán)色發(fā)射。在羧酸酯酶存在下，醋酸酯和4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯都被水解，ict效應(yīng)增強，從而導(dǎo)致強烈的綠色發(fā)射。然而，對于次氯酸根而言，它的加入導(dǎo)致4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯部分的消除，卻大大淬滅了探針的熒光。在這一點上，探針可以分別作為次氯酸根和羧酸酯酶的開-關(guān)和比率熒光探針。此外，吡啶鹽提供了一個有效的線粒體靶向位點，這使得合成的探針能夠檢測活細(xì)胞中的線粒體次氯酸根和羧酸酯酶。

技術(shù)特征：

1.基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針，其特征在于，其具有如下結(jié)構(gòu)：

2.如權(quán)利要求1所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s1中，有機溶液的溶劑為乙酸酐。

4.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s1中，4-甲基吡啶與對羥基苯甲醛的摩爾比為1:（0.6-1）。

5.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s2中，回流攪拌反應(yīng)時間為20-25h。

6.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s2中，用飽和nahco3水溶液洗滌，然后用無水na2so4干燥。

7.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s2中，從體積比為7:3的乙醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到化合物a。

8.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s3中，有機溶劑為乙腈，化合物a與4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯的摩爾比為1:（1-1.2）。

9.如權(quán)利要求2所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟s3中，反應(yīng)時間為3-5h。

10.如權(quán)利要求1所述的基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，所述基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針作為次氯酸根和羧酸酯酶熒光探針，應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體熒光成像。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，涉及熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。其技術(shù)方案為：基于吡啶基的水溶性雙響應(yīng)熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)：。本發(fā)明以乙?；鳛轸人狨ッ傅淖R別位點，末端芐基頻哪醇酯作為次氯酸根的反應(yīng)位點，制備出能夠同時響應(yīng)次氯酸根和羧酸酯酶的開?關(guān)和比率熒光探針；此外，吡啶鹽提供了一個有效的線粒體靶向位點，這使得該探針能夠檢測活細(xì)胞中的線粒體次氯酸根和羧酸酯酶。

技術(shù)研發(fā)人員：徐馮逸如,劉盼,殷曉峰,李金偉,白維坤,郭旭東
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東一諾威新材料有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/20