發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用于表達(dá)由含有提前終止密碼子的基因編碼的基因產(chǎn)物和/或治療由提前終止密碼子介導(dǎo)的病癥的方法和組合物。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)合成由遺傳密碼指導(dǎo)，該遺傳密碼包括61種編碼被摻入正在合成的蛋白質(zhì)中的氨基酸的三堿基對(duì)密碼子和3種終止蛋白質(zhì)合成的三堿基對(duì)密碼子(稱為停止或終止密碼子)。當(dāng)編碼蛋白質(zhì)的核酸序列突變?yōu)楹刑崆敖K止密碼子而不是下一個(gè)氨基酸的密碼子時(shí)，所得蛋白質(zhì)被提前終止，其通常無功能性或功能低于未截短或全長蛋白質(zhì)。這種突變，稱為無義突變，通常與許多不同的遺傳疾病有關(guān)，或者是許多不同遺傳疾病的病原體。

2、許多病癥與無義突變相關(guān)或由無義突變引起。這些包括癲癇，例如dravet綜合征、遺傳性癲癇伴熱性驚厥(gefs)、良性家族性嬰兒癲癇(bfie)、早期嬰兒癲癇性腦病(eiee)、lennox-gastaut綜合征、rett綜合征、ppm-x綜合征、大田原綜合征、發(fā)作性共濟(jì)失調(diào)、偏癱性偏頭痛、特發(fā)性全身性癲癇、foxg1綜合征、家族性局灶性癲癇伴可變病灶(ffevf)、兒童期發(fā)作癲癇性腦病、syngap1相關(guān)智力障礙、吡哆醇依賴性癲癇、家族性嬰兒肌陣攣癲癇(fime)、肌陣攣站立不能性癲癇、x連鎖智力障礙、部分性癲癇和發(fā)作性共濟(jì)失調(diào)、熱性驚厥、伴聽覺特征的常染色體顯性部分性癲癇(adpeaf)、pnpo缺乏、進(jìn)行性肌陣攣癲癇、動(dòng)作性肌陣攣-腎功能衰竭(amrf)、cdkl5缺乏癥、和良性家族性嬰兒驚厥(bfis)。

3、例如，dravet綜合征是一種罕見且災(zāi)難性形式的難治性癲癇，始于嬰兒期。最初，患者會(huì)經(jīng)歷持續(xù)很久的驚厥。在他們的第二年，開始出現(xiàn)其他類型的驚厥，這通常與發(fā)育衰退同時(shí)發(fā)生，可能是由于反復(fù)的腦缺氧。這會(huì)導(dǎo)致語言和運(yùn)動(dòng)技能發(fā)育不良。scn1a?(編碼電壓門控鈉通道α亞基nav1.1)、scn1b(編碼電壓門控鈉通道β1亞基)、scn2a?(編碼nav1.2)、scn3a?(編碼nav1.3)、scn9a?(編碼nav1.7)、gabrg2(編碼γ-氨基丁酸受體γ2亞基)、gabrd(編碼γ-氨基丁酸受體δ亞基)和/或pcdh19(編碼原鈣粘蛋白-19)基因的突變與dravet綜合征有關(guān)。

4、dravet綜合征可能由例如scn1a基因中的無義突變導(dǎo)致，其產(chǎn)生提前終止密碼子和未截短或功能性蛋白質(zhì)的缺乏或量減少所引起。scn1a基因通常編碼神經(jīng)元電壓門控鈉通道α亞基na(v)1.1。在小鼠模型中，已經(jīng)觀察到scn1a中的功能喪失突變導(dǎo)致鈉電流減少和海馬體gaba能中間神經(jīng)元的興奮性受損。

5、盡管迄今為止做出了努力，但本領(lǐng)域需要改良的組合物和方法來治療由提前終止密碼子介導(dǎo)的疾病，包括dravet綜合征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明部分基于trna?(例如，抑制性trna)的發(fā)現(xiàn)，該trna允許在否則將導(dǎo)致由基因中的提前終止密碼子(ptc)引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入由哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編碼的基因產(chǎn)物中。本發(fā)明進(jìn)一步部分基于trna能夠用于治療受試者由基因中的ptc介導(dǎo)的疾病的發(fā)現(xiàn)，該trna允許在否則將導(dǎo)致由基因中的ptc引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入由基因編碼的基因產(chǎn)物中，例如，本文所述的trna。

2、因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含表2中所列核苷酸序列的trna。在某些實(shí)施方案中，trna包含trna包含選自seq?id?no:?19-21、37、39、40、44、179、181、182和186的核苷酸序列。

3、在某些實(shí)施方案中，trna包含，例如，選自5-甲基尿苷、5-氨基甲?；谆蜍?、5-氨基甲?；?甲基-2-o-甲基尿苷、5-甲氧基-羰基甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷、假尿苷、二氫尿苷、1-甲基腺苷和肌苷的一種或多種天然存在的核苷酸修飾。

4、另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼任何前述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含1、2、3、4或多于4個(gè)拷貝數(shù)的編碼所述trna的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含對(duì)應(yīng)于野生型trna基因側(cè)翼的基因組dna序列的核苷酸序列。例如，在某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含表4中所列的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，表4中所列的核苷酸序列選自seq?id?no:?869-888。在某些實(shí)施方案中，表4中所列的核苷酸序列與編碼所述trna的核苷酸序列可操作地連接。在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)載體中，表4中所列的核苷酸序列位于編碼所述trna的核苷酸序列的5’。在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)載體中，表4中所列的核苷酸序列緊鄰編碼所述trna的核苷酸序列的5’(即，相鄰)。

5、另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼表3中所列trna的核苷酸序列的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體包含1、2、3、4或多于4個(gè)拷貝數(shù)的編碼所述trna的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，trna包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。

6、在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼表3中所列trna的核苷酸序列的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體進(jìn)一步包含表4中所列的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，trna包含選自seq?idno:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，表4中所列的核苷酸序列選自seq?id?no:?869-888。在某些實(shí)施方案中，表4中所列的核苷酸序列與編碼所述trna的核苷酸序列可操作地連接。在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)載體中，表4中所列的核苷酸序列位于編碼trna的核苷酸序列的5’。在某些實(shí)施方案中，在表達(dá)載體中，表4中所列的核苷酸序列緊鄰編碼trna的核苷酸序列的5’(即，相鄰)。

7、在任何前述表達(dá)載體的某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是病毒載體，例如dna病毒載體，例如腺相關(guān)病毒(aav)載體。

8、另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含任何前述trna或任何前述表達(dá)載體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，trna或表達(dá)載體不與另一部分，例如載體顆粒，例如氨基脂質(zhì)顆粒綴合或締合。在某些實(shí)施方案中，組合物不包含納米顆粒和/或氨基脂質(zhì)遞送化合物。

9、另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)由含有提前終止密碼子的基因編碼的功能性基因產(chǎn)物的方法，該方法包括將有效量的任何前述trna或表達(dá)載體引入細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由提前終止密碼子引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入基因產(chǎn)物中。在任何前述方法的某些實(shí)施方案中，該基因選自表5或表6中所列的基因。在某些實(shí)施方案中，該基因是scn1a基因。

10、另一方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)由含有提前終止密碼子的基因編碼的功能性基因產(chǎn)物的方法，該方法包括將有效量的表3中所列的trna?(例如，包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列的trna)，或包含編碼trna的核苷酸序列的表達(dá)載體引入細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由提前終止密碼子引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入基因產(chǎn)物中，其中該基因是表5中所列的基因。在某些實(shí)施方案中，該基因是scn1a基因。

11、在任何前述方法的某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞相比沒有所述trna的細(xì)胞含有更少的截短基因產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞相比沒有所述trna的細(xì)胞含有更大量的功能性基因產(chǎn)物。

12、在另一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中增加由含有提前終止密碼子的scn1a基因編碼的電壓門控鈉通道活性的方法，該方法包括將有效量的任何前述trna或任何前述表達(dá)載體引入細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由提前終止密碼子引起的截短的scn1a基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入scn1a基因產(chǎn)物中。

13、在另一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中增加由含有提前終止密碼子的scn1a基因編碼的電壓門控鈉通道活性的方法，該方法包括將有效量的表3中所列的trna?(例如，包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列的trna)，或包含編碼所述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體引入細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由提前終止密碼子引起的截短的scn1a基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入scn1a基因產(chǎn)物中。

14、在任何前述方法的某些實(shí)施方案中，其中基因是scn1a基因，用所述trna產(chǎn)生的scn1a基因產(chǎn)物是功能性scn1a基因產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，功能性scn1a基因產(chǎn)物相比截短的scn1a基因產(chǎn)物具有更大的活性。在某些實(shí)施方案中，功能性scn1a基因產(chǎn)物是nav1.1蛋白。在某些實(shí)施方案中，功能性scn1a基因產(chǎn)物包含seq?id?no:?863-868中任一個(gè)的氨基酸序列。

15、在任何前述方法的某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，例如神經(jīng)元。在某些實(shí)施方案中，trna在細(xì)胞中變?yōu)榘滨；?/p>

16、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中治療提前終止密碼子介導(dǎo)的病癥的方法，其中受試者具有含有提前終止密碼子的基因，該方法包括向受試者施用有效量的任何前述trna或任何前述表達(dá)載體，從而治療受試者的病癥。在某些實(shí)施方案中，病癥選自表5或表6中所列的病癥。

17、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中治療提前終止密碼子介導(dǎo)的病癥的方法，其中受試者具有含有提前終止密碼子的基因，該方法包括向受試者施用有效量的表3中所列的trna?(例如，包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列的trna)?，或包含編碼所述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體，從而治療受試者的病癥，其中病癥是表5中所列的病癥。

18、在任何前述治療方法的某些實(shí)施方案中，病癥是癲癇，例如，dravet綜合征。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括向受試者施用有效量的另一種藥劑，例如diacomit?(司替戊醇)、epiodolex?(大麻二酚)、生酮飲食、onfi?(氯巴占)、topamax?(托吡酯)、芬氟拉明或丙戊酸。

19、在任何前述方法的某些實(shí)施方案中，其中基因是scnla基因，scnla基因中的提前終止密碼子由選自c.664c>t、c.1129c>t、c.1492a>t、c.1624c>t、c.1738c>t、c.1837c>t、c.2134c>t、c.2593c>t、c.3637c>t、c.3733c>t、c.3985c>t、c.4573c>t、c.5656c>t和c.5734c>t的突變或突變的組合引起。在某些實(shí)施方案中，提前終止密碼子由選自c.1738c>t和c.3985c>t的突變引起。

20、本發(fā)明的這些和其他方面和特征在以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求中描述。

21、本發(fā)明涉及以下實(shí)施方案：

22、1.?trna，其包含表2中所列的核苷酸序列。

23、2.?實(shí)施方案1所述的trna，其中所述trna包含選自seq?id?no:?19-21、37、39、40、44、179、181、182和186的核苷酸序列。

24、3.?實(shí)施方案1或2所述的trna，其中所述trna包含天然存在的核苷酸修飾。

25、4.?實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的trna，其中所述trna包含選自5-甲基尿苷、5-氨基甲?；谆蜍?、5-氨基甲?；?甲基-2-o-甲基尿苷、5-甲氧基-羰基甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷、假尿苷、二氫尿苷、1-甲基腺苷和肌苷的一種或多種核苷酸修飾。

26、5.?表達(dá)載體，其包含編碼實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的trna的核苷酸序列。

27、6.?實(shí)施方案5所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含1、2、3、4或多于4個(gè)拷貝數(shù)的編碼所述trna的所述核苷酸序列。

28、7.?實(shí)施方案5或6所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含表4中所列的核苷酸序列。

29、8.?實(shí)施方案7所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含選自seq?id?no:?869-888的核苷酸序列。

30、9.?表達(dá)載體，其包含編碼表3中所列trna的核苷酸序列，其中所述表達(dá)載體包含1、2、3、4或多于4個(gè)拷貝數(shù)的編碼所述trna的所述核苷酸序列。

31、10.?表達(dá)載體，其包含編碼表3中所列的trna的核苷酸序列，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含表4中所列的核苷酸序列。

32、11.?實(shí)施方案9或10所述的表達(dá)載體，其中所述trna包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。

33、12.?實(shí)施方案10或11所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包含選自seq?id?no:869-888的核苷酸序列。

34、13.?實(shí)施方案5-12中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是病毒載體。

35、14.?實(shí)施方案13所述的表達(dá)載體，其中所述病毒載體是dna病毒載體。

36、15.?實(shí)施方案13或14所述的表達(dá)載體，其中所述病毒載體是腺相關(guān)病毒(aav)載體。

37、16.?藥物組合物，其包含實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的trna或?qū)嵤┓桨?-15中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

38、17.?實(shí)施方案16所述的藥物組合物，其中所述trna或表達(dá)載體不與另一部分綴合或締合。

39、18.?實(shí)施方案17所述的藥物組合物，其中所述trna或表達(dá)載體不與載體顆粒綴合或締合。

40、19.?實(shí)施方案8所述的藥物組合物，其中所述載體顆粒是氨基脂質(zhì)顆粒。

41、20.?實(shí)施方案15-19中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物不包含納米顆粒。

42、21.?實(shí)施方案15-20中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物不包含氨基脂質(zhì)遞送化合物。

43、22.?在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)由含有提前終止密碼子的基因編碼的功能性基因產(chǎn)物的方法，所述方法包括將有效量的實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的trna或?qū)嵤┓桨?-15中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由所述提前終止密碼子引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入所述基因產(chǎn)物中。

44、23.?實(shí)施方案22所述的方法，其中所述細(xì)胞相比沒有所述trna的細(xì)胞含有更少的截短基因產(chǎn)物。

45、24.?實(shí)施方案22或23所述的方法，其中所述細(xì)胞相比沒有所述trna的細(xì)胞含有更大量的功能性基因產(chǎn)物。

46、25.?實(shí)施方案22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因是表5或表6中所列的基因。

47、26.?實(shí)施方案25所述的方法，其中所述基因是表5中所列的基因。

48、27.?在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)由含有提前終止密碼子的基因編碼的功能性基因產(chǎn)物的方法，所述方法包括將有效量的表3中所列的trna或包含編碼所述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由所述提前終止密碼子引起的截短基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入所述基因產(chǎn)物中，其中所述基因是表5中所列的基因。

49、28.?實(shí)施方案27所述的方法，其中所述trna包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。

50、29.?實(shí)施方案22-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因是scn1a基因。

51、30.?在細(xì)胞中增加由含有提前終止密碼子的scn1a基因編碼的電壓門控鈉通道活性的方法，所述方法包括將有效量的實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)所述的trna或?qū)嵤┓桨?-15中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由所述提前終止密碼子引起的截短的scn1a基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入所述scn1a基因產(chǎn)物中。

52、31.?在細(xì)胞中增加由含有提前終止密碼子的scn1a基因編碼的電壓門控鈉通道活性的方法，所述方法包括將有效量的表3中所列的trna，或包含編碼所述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中，從而允許在否則將導(dǎo)致由所述提前終止密碼子引起的截短的scn1a基因產(chǎn)物的位置處將氨基酸摻入所述scn1a基因產(chǎn)物中。

53、32.?實(shí)施方案31所述的方法，其中所述trna包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。

54、33.?實(shí)施方案29-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中用所述trna產(chǎn)生的所述scn1a基因產(chǎn)物是功能性scn1a基因產(chǎn)物。

55、34.?實(shí)施方案33所述的方法，其中所述功能性scn1a基因產(chǎn)物相比所述截短的scn1a基因產(chǎn)物具有更大的活性。

56、35.?實(shí)施方案33或34所述的方法，其中所述功能性scn1a基因產(chǎn)物是nav1.1蛋白。

57、36.?實(shí)施方案33-35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述功能性scn1a基因產(chǎn)物包含seq?id?no:?863-868中的任一項(xiàng)。

58、37.?實(shí)施方案36所述的方法，其中所述功能性scn1a基因產(chǎn)物包含seq?id?no:863或seq?id?no:?864。

59、38.?實(shí)施方案22-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。

60、39.?實(shí)施方案22-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述trna在所述細(xì)胞中變?yōu)榘滨；?/p>

61、40.?在有此需要的受試者中治療提前終止密碼子介導(dǎo)的病癥的方法，其中所述受試者具有含有提前終止密碼子的基因，所述方法包括向所述受試者施用有效量的實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的trna或?qū)嵤┓桨?-15中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，從而治療所述受試者的所述病癥。

62、41.?實(shí)施方案40所述的方法，其中所述病癥是表5或表6中所列的病癥。

63、42.?實(shí)施方案41所述的方法，其中所述病癥是表5中所列的病癥。

64、43.?在有此需要的受試者中治療提前終止密碼子介導(dǎo)的病癥的方法，其中所述受試者具有含有提前終止密碼子的基因，所述方法包括向所述受試者施用有效量的表3中所列的trna，或包含編碼所述trna的核苷酸序列的表達(dá)載體，從而治療所述受試者的所述病癥，其中所述病癥是表5中所列的病癥。

65、44.?實(shí)施方案43所述的方法，其中所述trna包含選自seq?id?no:?6-9、11、16-18、22、35、36、38、45、178、180和187的核苷酸序列。

66、45.?實(shí)施方案40-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病癥是dravet綜合征。

67、46.?實(shí)施方案45所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括向所述受試者施用司替戊醇、大麻二酚、生酮飲食、氯巴占、托吡酯、芬氟拉明或丙戊酸。

68、47.?實(shí)施方案45或46所述的方法，其中所述基因是scn1a。

69、48.?實(shí)施方案40-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。

70、49.?實(shí)施方案29-39或47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述scn1a基因中的所述提前終止密碼子由選自c.664c>t、c.1129c>t、c.1492a>t、c.1624c>t、c.1738c>t、c.1837c>t、c.2134c>t、c.2593c>t、c.3637c>t、c.3733c>t、c.3985c>t、c.4573c>t、c.5656c>t和c.5734c>t的突變引起。

71、50.?實(shí)施方案49所述的方法，其中所述scn1a基因中的所述提前終止密碼子由選自c.1738c>t和c.3985c>t的突變引起。