本發(fā)明屬于分析檢測(cè)，具體涉及一種用于檢測(cè)固體表面致病菌的集成化微針陣列器件與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌性感染已經(jīng)成為危害全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)的罪魁禍?zhǔn)?，?duì)人類(lèi)生存的環(huán)境造成極大威脅，根據(jù)世界衛(wèi)生組織提供的數(shù)據(jù)，全球每年近有10％的人口因食用受污染的食物而患病，食源性病原體每年導(dǎo)致約6億人患病和42萬(wàn)人死亡。大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等最常見(jiàn)食源性致病菌引發(fā)的疾病已經(jīng)成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)重大問(wèn)題，它們多為環(huán)境宿主，通過(guò)食用未煮熟或受污染的食物進(jìn)行傳播，細(xì)菌及其毒素是食源性疾病中最重要的病原物，通常傳播速度較快，一旦被感染，導(dǎo)致高發(fā)病率與致死率的食物中毒，對(duì)人體健康、環(huán)境安全造成嚴(yán)重危害。

2、固體媒介(尤其是固體表面)中致病菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展則受限于特定的采樣方法(接觸碟法或擦拭法)，檢測(cè)過(guò)程分散、耗時(shí)、增加了樣本污染的風(fēng)險(xiǎn)。為了彌補(bǔ)固體表面致病菌檢測(cè)的短板，人們一直專(zhuān)注于探索集成化的原位監(jiān)測(cè)生物傳感方法。構(gòu)建簡(jiǎn)單、快速且成本低廉的大腸桿菌檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)固體媒介食源性致病菌的即時(shí)檢測(cè)，減輕食源性疾病對(duì)公共衛(wèi)生的負(fù)面影響，對(duì)于預(yù)防疾病的發(fā)生以及保障人體健康具有重要意義。

3、微針陣列是由微米級(jí)(長(zhǎng)度<1000微米)針尖組成的裝置，具有體積小、比表面積大等特點(diǎn)，已廣泛用于生物標(biāo)志物微創(chuàng)傳感的研究。這些裝置具有在原位(貼敷在預(yù)想的位置)或非原位(去除后進(jìn)行分析)反饋目標(biāo)位點(diǎn)靶標(biāo)信息的優(yōu)點(diǎn)，可能是用于固體表面致病菌檢測(cè)的一個(gè)合理的方法。在過(guò)去的幾十年里，微針陣列已被探索出不同的類(lèi)型并賦予了其不同的功能。例如，溶解微針可將形成針狀結(jié)構(gòu)的聚合物溶解并釋放包埋的藥物，水凝膠微針固有的親水性使得其能夠在液體中膨脹被動(dòng)提取其中的靶標(biāo)，多孔微針負(fù)載大顆粒物質(zhì)防止其泄露。因此，通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)將不同的試劑加載到微針的不同區(qū)域，它們能夠具有原位采樣、反應(yīng)、分析的能力。這能夠避免檢測(cè)過(guò)程中樣品受環(huán)境的污染。此外，微針作為獨(dú)立的微反應(yīng)單元，可以在一次測(cè)試中提供多達(dá)100個(gè)傳感結(jié)果，并且對(duì)獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行平均可以進(jìn)一步減小手動(dòng)操作的誤差，這對(duì)于分析不均質(zhì)的固體表面尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)固體表面致病菌的集成化微針陣列器件與應(yīng)用，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種集細(xì)菌裂解、主動(dòng)采樣和細(xì)菌檢測(cè)等過(guò)程于一體的簡(jiǎn)單、便攜式的微針陣列器件，可實(shí)現(xiàn)對(duì)固體表面致病菌的檢測(cè)，相比較傳統(tǒng)檢測(cè)固體表面致病菌的方法，本發(fā)明所述的集成化微針陣列器件，操作簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)業(yè)人員耗時(shí)操作，且僅需幾微升樣本即可完成檢測(cè)，對(duì)固體表面致病菌的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種集成化微針陣列器件，所述集成化微針陣列器件包括檢測(cè)細(xì)菌的微針陣列層和細(xì)菌裂解層，所述的細(xì)菌裂解層是覆蓋于微針陣列層外側(cè)的一層多糖層，所述的微針陣列層內(nèi)包含磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針，所述細(xì)菌裂解層內(nèi)包含溶菌酶。

4、進(jìn)一步地，所述的微針陣列層的材質(zhì)包括聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)和甲基丙烯化透明質(zhì)酸(meha)；所述的細(xì)菌裂解層的材質(zhì)包括普魯藍(lán)糖。

5、進(jìn)一步地，所述的磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針的結(jié)構(gòu)如seq?id?no:3所示。

6、進(jìn)一步地，所述的微針陣列層和細(xì)菌裂解層的形狀包括圓錐體。

7、第二方面，本發(fā)明提供上述的集成化微針陣列器件的制備方法，包括如下步驟：將聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯化透明質(zhì)酸和光引發(fā)劑的混合液加入到pdms微針陣列模具中，通過(guò)離心作用使混合液進(jìn)入模具，向混合液中加入磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針，再利用磁吸作用使混合液中的磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針載入微針內(nèi)部；將載有混合液的pdms模具在紫外燈下照射10～60s后脫模，制成檢測(cè)細(xì)菌的微針陣列，然后在制備的微針陣列的微針表面滴加含有溶菌酶的普魯藍(lán)糖溶液，自然風(fēng)干后，微針陣列表面覆蓋一層普魯藍(lán)糖層，即得集成化微針陣列器件。

8、進(jìn)一步地，聚乙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯化透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為30：1～5：1。

9、進(jìn)一步地，光引發(fā)劑為lap，加入量為聚乙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯化透明質(zhì)酸總質(zhì)量的0.1wt％～1wt％。

10、進(jìn)一步地，所述的普魯藍(lán)糖溶液的終濃度為5wt％～10wt％，溶菌酶含量為100～500μg/ml。

11、第三方面，本發(fā)明提供上述的集成化微針陣列器件的應(yīng)用，在檢測(cè)固體表面致病菌的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用包括如下步驟：

13、(1)將緩沖液滴加至待測(cè)固體表面；

14、(2)將所述的集成化微針陣列器件的微針陣列放置在步驟(1)的固體表面上進(jìn)行反應(yīng)；

15、(3)反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)集成化微針陣列器件的微針陣列的熒光強(qiáng)度，利用image?j軟件對(duì)熒光強(qiáng)度掃描并定量，以實(shí)現(xiàn)固體表面致病菌的檢測(cè)。

16、進(jìn)一步地，所述致病菌包括大腸桿菌。

17、進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的緩沖液：10mm?tri-hcl，1mm?edta，1m?nacl，0.01％-0.1％?tween-20，ph＝7.5。

18、進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的緩沖液中的菌含量為103～109cfu/ml。

19、進(jìn)一步地，步驟(2)中反應(yīng)的時(shí)間為30～90min。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

21、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種集細(xì)菌裂解、主動(dòng)采樣和細(xì)菌檢測(cè)等過(guò)程于一體的簡(jiǎn)單、便攜式的微針陣列器件，可實(shí)現(xiàn)對(duì)固體表面致病菌的檢測(cè)。相比較傳統(tǒng)檢測(cè)固體表面致病菌的方法，本發(fā)明所述的集成化微針陣列器件，操作簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)業(yè)人員耗時(shí)操作，且僅需幾微升樣本即可完成檢測(cè)，對(duì)固體表面致病菌的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種集成化微針陣列器件，其特征在于，所述集成化微針陣列器件包括檢測(cè)細(xì)菌的微針陣列層和細(xì)菌裂解層，所述的細(xì)菌裂解層是覆蓋于微針陣列層外側(cè)的一層多糖層，所述的微針陣列層內(nèi)包含磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針，所述細(xì)菌裂解層內(nèi)包含溶菌酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成化微針陣列器件，其特征在于，所述的微針陣列層的材質(zhì)包括聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)和甲基丙烯化透明質(zhì)酸(meha)；所述的細(xì)菌裂解層的材質(zhì)包括普魯藍(lán)糖；所述的微針陣列層和細(xì)菌裂解層的形狀包括圓錐體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成化微針陣列器件，其特征在于，所述的磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針的結(jié)構(gòu)如seq?id?no:3所示。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的集成化微針陣列器件的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯化透明質(zhì)酸和光引發(fā)劑的混合液加入到pdms微針陣列模具中，通過(guò)離心作用使混合液進(jìn)入模具，向混合液中加入磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針，再利用磁吸作用使混合液中的磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針載入微針內(nèi)部；將載有混合液的pdms模具在紫外燈下照射10～60s后脫模，制成檢測(cè)細(xì)菌的微針陣列，然后在制備的微針陣列的微針表面滴加含有溶菌酶的普魯藍(lán)糖溶液，自然風(fēng)干后，微針陣列表面覆蓋一層普魯藍(lán)糖層，即得集成化微針陣列器件。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，聚乙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯化透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為30：1～5：1；光引發(fā)劑為lap，加入量為聚乙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯化透明質(zhì)酸總質(zhì)量的0.1wt％～1wt％。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的普魯藍(lán)糖溶液的終濃度為5wt％～10wt％，溶菌酶含量為100～500μg/ml。

7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的集成化微針陣列器件的應(yīng)用，其特征在于，在檢測(cè)固體表面致病菌的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述致病菌包括大腸桿菌。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中所述的緩沖液中的菌含量為103～109cfu/ml；步驟(2)中反應(yīng)的時(shí)間為30～90min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種用于檢測(cè)固體表面致病菌的集成化微針陣列器件與應(yīng)用，屬于分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯化透明質(zhì)酸和光引發(fā)劑的混合液加入到微針陣列模具中，然后包埋磁珠固定的檢測(cè)大腸桿菌的響應(yīng)型探針；將載有混合液的模具在紫外燈下照射10～60s后脫模，制成檢測(cè)細(xì)菌的微針陣列，然后在制備的微針陣列的微針表面滴加含有溶菌酶的普魯藍(lán)糖溶液，自然風(fēng)干后，即得集成化微針陣列。該微針陣列器件集細(xì)菌裂解、主動(dòng)采樣和細(xì)菌檢測(cè)等過(guò)程于一體，避免了傳統(tǒng)方法復(fù)雜耗時(shí)的操作過(guò)程，具有便攜、簡(jiǎn)單、快捷、低成本等分析性能，對(duì)多種復(fù)雜固體表面分析具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：劉猛,盛濤,薛偉,張蕊,常洋洋
受保護(hù)的技術(shù)使用者：大連理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/5